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(無題) 削除/引用 No.3510-7 - 2010/11/16 (火) 11:00:48 - 310 ベタインを添加したところ、シーケンスデータが改善されました。以前は読めなかったpolydGの手前の配列が読めるようになりました。しかしながらpolydGを超えるとシグナルが急激に低下して読めない減少が発生しました。 そこでラボで作ったTaqを加えたところ、polydGまではBigDye preMixと波形の変化を起こすことなく読め、polydGを超えてもさほどシグナルが落ちませんでしたが、polydG後スリップを起こしたようで、重複ピークが多く読み取りはできませんでした。現在のTemplateはcloneのコロニーをPCRしたものなので。PCRとシーケンスのどっちで、スリップを起こしたか分かりません。そのうちミニプレップをするつもりですが、このような経験をされた方いましたら、どのように解決されたか教えていただければ幸いです。 とりあえず逆から読んでみようとは思い、実行中です。

(無題) 削除/引用 No.3510-6 - 2010/11/13 (土) 14:15:40 - 310 シーケンス反応液にPCRに使っているDMSOとDTTを加えたところ、感度が上がり長いDNAで見られるシグナルの減少も改善されました。しかし、まだCが12個続く周辺は読めないです。ベタインはこれから試します。

(無題) 削除/引用 No.3510-5 - 2010/11/11 (木) 20:35:44 - 310 stu様 ありがとうございます。昔CEQ2000のキットでplateエタ沈してたころは、沈殿が見えていて、しかも反転してエタノール除去するときよく落ちてしまったので、多少臆病になっています。一時順調だったシーケンス反応が、急にうまくいかなくなったため、XTerminatorを一時中止してエタ沈で精製していますが、除去し損ねたDyeのピークしか見えないので反応条件の検討からやり直しています。 中年様 ありがとうございます。LPAを使っている方からのご助言をいただきうれしい限りです。変性剤はベタインやDMSOのことです。以前委託でシーケンスしてもらったとき、片側はきれいに読めて、もう片側はコロニーがミックスしているようなデータが出たことがありました。そこの係りの人がベタインを加えて、再反応したところきれいに読めたものですから、BigDyeVer3.1のようなGC配列にも強いと言われるキットにも変性剤が入っているのでは、と勘ぐっております。

(無題) 削除/引用 No.3510-4 - 2010/11/11 (木) 19:25:55 - 中年 先はああ書きましたが、SAM溶液というのが変性剤なんでしょうか。だとしたら、Xterminatorの容量は減らせないですね。

(無題) 削除/引用 No.3510-3 - 2010/11/11 (木) 19:09:33 - 中年 希釈して大丈夫なのは、酵素も基質も大過剰だからだと思います（変性剤って？）。 Xterminatorはゲル濾過みたいな原理なんじゃないでしょうか。だとすれば、希釈した反応系なら減らしても大丈夫だと思います（使ってないので経験はありません）。 エタノール沈殿の時のLPAはキャピラリータイプでも使っています。いたんでるかどうかは分かりませんが、キャピラリーやポリマーの寿命が特に短くなったという印象はありません。LPAを使うと、ペレットが見えるかどうかよりも、エタノール沈殿で氷上でインキュベートしなくともすぐに遠心できるし、さらに回収率がぐっと上がるのがメリットです。いつもの条件でインジェクションするとシグナルが飽和してしまうので、電圧も時間もディフォルトの条件の半分にしてるほど。

(無題) 削除/引用 No.3510-2 - 2010/11/11 (木) 18:45:36 - stu > > 希釈反応したシーケンス産物をエタ沈してみたのですが、当たり前ながらペレットが見えません。共沈剤を入れようとABIに相談したら、キャピラリが痛むから入れるなと言われました。過去のトピックでLPAによる共沈の話が出ていましたが、あれはゲルタイプ用の方法なのでしょうか？　 希釈してシークエンスした産物を普通にエタチンしてキャピラリ泳動しております。ペレットが見える必要はないので、共沈剤は使用しておりません。それでもシークエンス産物がロスって、読めなかったことはありませんよ 。

BigDyeキットの希釈と精製 削除/引用 No.3510-1 - 2010/11/11 (木) 16:57:19 - 310 BigDyeTerminator sequencingキットの希釈はTrisとMgCl2の入った希釈バッファで行なわれていますが、Dyeだけでなくpremixの中の酵素や変性剤も薄まっているはずなのに、10-20倍希釈してもシーケンス反応に致命的支障が出ないのは何故でしょうか？PCRほど反応効率に依存しないといっても不思議な気がします。 また希釈したBigDyeのシーケンス産物をBigDye Xterminatorで精製するとき、希釈率にかかわらず、希釈しないときと同じ量の粒子の入った溶液（多分これでフリーのDyeを吸着するのだと思っています）を入れます。SAM溶液と粒子の入った溶液が使用量と同じ比率で組み合わさっているため、SAM溶液を自作または一部何かで代替しない限りは、粒子のみ減らしても節約にならないのは分かっているのですが、当方が使っている310では遠心し上清を別チューブに移さなければならないため、粒子が少ない方が楽にはなりそうです。 このことにかかわらずBigDye Xterminatorのプロトコールを改変してうまく言った又は失敗したなど経験された方がいましたら、何をしたら何が起きたか教えてください。 希釈反応したシーケンス産物をエタ沈してみたのですが、当たり前ながらペレットが見えません。共沈剤を入れようとABIに相談したら、キャピラリが痛むから入れるなと言われました。過去のトピックでLPAによる共沈の話が出ていましたが、あれはゲルタイプ用の方法なのでしょうか？　 ブールーデキストランの使用もABIに固くとめられましたが、購入したマトリックスに入っていて複雑な気持ちになりました。ちなみに1回だけの泳動のせいかも知れませんが、これらを泳動したあとも何の異常もありませんでした。

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