みなさん、早々のレスを誠にありがとうございます。
全てのレスを熟読させていただきました。大変、ありがたく感じています。
Pumpkinさんの経験に基づいたご指摘が今回の現象と一致していると考えています。
＞転写産物が出来ていないときはエチブロがフリーになっていて、よく観察できるようになった。
大変、参考になります。アドバイスの通り次回はエチブロの量を少なくしてみます。
「レーンより上流にバンド」が出るようなことは、ラボのメンバーはこれまで見たことなかったそうで、うまくいかない理由をいくつも考えてしまい困っていました。
こちらに相談して、どうやらin vitro転写がうまくいっていないようだということは分かり、とても助かりました。
実験がうまくいっているラボのメンバー達によると、in vitro転写では鋳型となるDNAの精度が鍵である・・・そうで、私のサンプルの状態が悪いと予想はつけています。
精製、転写、電気泳動による確認まで、ラボ内で共通の試薬（キット、泳動バッファー、T7ポリメラーゼ、基質、など）を使っています。
異なるのはサンプルそのものだけ（と思う）ですが、他のメンバーは電気泳動のパターンもきれいに出ていて、改善点が見つけずにいられます。
プロモータの配列、鋳型となる領域の塩基配列、制限酵素の認識配列についても確認済みです。
また、DNA濃度についてもチェックはしているのですが、他にも何か見落としがあるのかもしれません。
だらだら書いてしまいましたが、in vitro転写について文章でご相談することが難しいような気がしてきました。
「レーンより上流にバンド」について、納得のいくお答えをちょうだいできましたので、こちらのトピは解決済みとさせていただきます。
重ね重ねになりますが、みなさん、レスをありがとうございました。
また、他の悩める研究職の方にとって、このトピが参考になると幸いです。 |
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