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ありがとうございます 削除/引用 No.354-10 - 2009/04/28 (火) 13:09:47 - FACS Tbさん ありがとうございます。 アドバイスを参考にして、２次抗体後に固定したいと思います。

固定液 削除/引用 No.354-9 - 2009/04/28 (火) 08:41:11 - Tb 固定は1-2% PFA-PBSです。FSC-SSC scatterが生細胞に近いところに保たれます。

固定はすべて終わったあとに 削除/引用 No.354-8 - 2009/04/28 (火) 08:28:36 - Tb すぐに固定しないと外れるような抗体は、洗い中にもばんばん外れているでしょうから、それはもうFACSに適していない抗体といえます。でも通常は、固定しなくても抗体が外れていって蛍光が弱くなるということはありません。ですから固定は最後にすればいいです。細胞膜が破けるとノンスペの元ですから。

(無題) 削除/引用 No.354-7 - 2009/04/28 (火) 08:07:40 - FACS Tbさん ありがとうございます。 染色後に固定する場合は、一次抗体後か二次抗体後どちらがいいのでしょうか？ 蛍光の減弱を考えると、一次抗体後に固定がいいのかとも思いますが、いかがでしょうか？ 固定方法は、パラホルム固定とエタノール固定のどちらがいいのでしょうか？ 初心者の質問で申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

固定 削除/引用 No.354-6 - 2009/04/28 (火) 08:01:38 - Tb 表面FACSの場合通常、固定しないでそのまますぐにFACS解析するか、抗体染色のあとに固定して後日でも測定できるように保存するか、です。先に固定してしまうのは、トピ主さんの書いているように本当に表面を見ているのかわからなくなってきます。

(無題) 削除/引用 No.354-5 - 2009/04/28 (火) 07:48:11 - FACS みなさんありがとうございます。 EDTAでも問題ないみたいなので、安心しました。 ちなみに、固定の方法なんですが、今回の質問のように細胞間接着分子をFACSで解析する場合に、どのような方法を用いていますか？ 固定の方法によっては、パーメライズも同時にされてしまい、細胞表面の発現を反映しない可能性があるとも聞いたことがあるので、皆さんが行われている方法を教えていただければと思います。 ちなみに、私が現在考えている方法は、1%パラホルムアルデヒドでの固定を考えています。

(無題) 削除/引用 No.354-4 - 2009/04/20 (月) 11:19:16 - DNAI ルチーンでGPIアンカータンパクのFACS解析をやっています。 Hela, CHO, 293Tは、Dissociationバッファー（Invitrogen）にて問題なく回収できています。 接着力の弱い細胞は5分程度、強い細胞は37℃で10分程度放置すれば剥がれます。 おそらくEDTAでも問題ないと思いますが、高いものではないですので一度試されてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.354-3 - 2009/04/20 (月) 10:47:55 - ＊ 私もEDTA-PBSが適切と思いますが、トリプシンではがした細胞を使用している人を多く見かけます。 トリプシンの基質になり得ない蛋白であれば良いのですが、概してそうでは無いように思います。 基質部分が、細胞の外側ではないから問題ない？つまり、細胞質側であれば使用にはもんだ良いのでしょうか？膜貫通部分なら良さげな気もしますけど。 トリプシンではがした細胞を使用したFACSの信頼性はあると考えてよいのですか？

EDTA + ピペッティングでO.K.です 削除/引用 No.354-2 - 2009/04/19 (日) 03:48:21 - Tb もちろん細胞の種類によると思いますが、たいていは1mM EDTA-PBSに37℃ 10分おいたあと、パスツールあるいは1 mlピペットチップでのピペッティングでほぼシングルセルになります。培養細胞はEDTA処理で、細胞間接着が先に崩れフラスコに丸くなってくっついていたり、逆にフラスコから細胞シートみたいにはがれたりするので、それを顕微鏡で確認したらピペッティングをしてみてください。

FACSでの細胞間接着分子 削除/引用 No.354-1 - 2009/04/18 (土) 23:27:32 - FACS 今、接着細胞での細胞間接着分子の発現を検討していますが、 サンプルの処理の仕方で迷っています。 通常の継代のようにトリプシンを使用すると、発現した細胞間接着分子も壊れてしまうと思いますので、EDTAのみでの回収を考えています。 ただし、EDTAだけでははがすことが出来ないのでは？と考えていますので、セルスクレイパーやセルリフターの使用を検討しています。 このような状況でしっかりとFACSにて発現は確認できるでしょうか？ それとも、細胞固定を先におこなってから細胞をはがすほうがいいのでしょうか？ このやり方でやられたいる方の感想、または別の方法でやられている方の経験を教えていただければ、助かります。

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