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サンプル劣化後のSDS-PAGE トピック削除
No.3561-TOPIC - 2010/11/22 (月) 19:21:33 - ぱげ
こんばんは。毎度勉強をさせていただいています。
以前PAGEゲルの質問をさせていただきましたぱげです。

今回はSDS-PAGEの電気泳動のサンプルについてです。
ゲル作製以降、何度か同じサンプルを詠動していますが、
先々週まではキレイなバンドが確認できていたものが、最近(特に今日)は流れも遅く、CBB染色後の脱色ではスメア状のバンドしか確認できませんでした。

単純にタンパクのサンプルを出し入れを繰り返すことで、そこまで急激に劣化はすすむものでしょうか?そしてそれは原因のひとつになり得るのでしょうか?

今回もしょーもない質問かもしれませんが、よろしければご意見を下さい
m(_ _)m
 
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(無題) 削除/引用
No.3561-9 - 2010/12/01 (水) 08:02:17 - UC
茶々入れで申し訳ないですが、何が原因だったのかこの文面からは分かりませんねぇ。

(無題) 削除/引用
No.3561-8 - 2010/12/01 (水) 07:50:19 - ぱげ
返信が遅れまして申し訳有りませんでした!
私事でなかなか着手できず、昨晩トライしたところです。

@β-MEを10%再追加
A詠動バッファー作り直し
Bサンプル(精製し直し)-80℃保存下

を試行したところ、バンドのスメアーは改善されました。
改めまして回答をくださったみなさま、ありがとうございました

(無題) 削除/引用
No.3561-7 - 2010/11/23 (火) 05:05:30 - 宗
別のサンプルを泳動してみたら?
マーカーはスメア状になってなくてちゃんと見えるんですか?

(無題) 削除/引用
No.3561-6 - 2010/11/23 (火) 00:45:13 - は
>[Re:4] とさんは書きました :
> >タンパクのサンプルを出し入れを繰り返すことで
> 冷凍庫から出し入れってコトですか?ほぼ問題にならないと思います
>
>

冷凍庫に入れっぱなしにしておいても劣化します。

(無題) 削除/引用
No.3561-5 - 2010/11/22 (月) 23:12:36 - ATGC
新たにbe-ta MEを1/20量くらい追加してみたらどう。新たに加熱する必要はないよ。スメアになってきたということなので、溶かしたり凍らせたりしてる間に、サンプル中の還元剤が酸化されて効きが悪くなってきて蛋白質のチオールの再酸化とかが中途半端に起きているんじゃないかな。個々のバンドが変な感じにうすくてぼーっとしてないかな、それかバンドがいまいち締まりがない感じみたいな。だったらたぶんそうかも。というかそういうことあって還元剤追加したら直った、すごい昔だけど。SDS変性させててもプロテアーゼが働く事も例外的だけどあるから、分解の可能性ももしかしたらあり得るとおもうけどね。とりあえず大事なサンプルで何度も電気泳動するならば始めに少量ずつ分注して-80C保存したほうがいいよ。

(無題) 削除/引用
No.3561-4 - 2010/11/22 (月) 22:22:57 - と
>タンパクのサンプルを出し入れを繰り返すことで
冷凍庫から出し入れってコトですか?ほぼ問題にならないと思います

(無題) 削除/引用
No.3561-3 - 2010/11/22 (月) 21:53:28 - 多分ですが
泳動バッファーが間違っている可能性はありませんか?
流れるのが遅いとか、スメアとか
泳動に問題があるような気がするのですが。

(無題) 削除/引用
No.3561-2 - 2010/11/22 (月) 21:23:07 - は

> 単純にタンパクのサンプルを出し入れを繰り返すことで、そこまで急激に劣化はすすむものでしょうか?

:進む可能性はあると言わざるを得ない


そしてそれは原因のひとつになり得るのでしょうか?

:原因のひとつになり得ると言わざるを得ない

以上

サンプル劣化後のSDS-PAGE 削除/引用
No.3561-1 - 2010/11/22 (月) 19:21:33 - ぱげ
こんばんは。毎度勉強をさせていただいています。
以前PAGEゲルの質問をさせていただきましたぱげです。

今回はSDS-PAGEの電気泳動のサンプルについてです。
ゲル作製以降、何度か同じサンプルを詠動していますが、
先々週まではキレイなバンドが確認できていたものが、最近(特に今日)は流れも遅く、CBB染色後の脱色ではスメア状のバンドしか確認できませんでした。

単純にタンパクのサンプルを出し入れを繰り返すことで、そこまで急激に劣化はすすむものでしょうか?そしてそれは原因のひとつになり得るのでしょうか?

今回もしょーもない質問かもしれませんが、よろしければご意見を下さい
m(_ _)m

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