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免疫染色用の抗体用抗原作成 トピック削除
No.3563-TOPIC - 2010/11/22 (月) 23:54:15 - 共有結合
目的の抗体を得るために、通常私のラボでは、大腸菌で目的タンパク質の断片を過剰発現したのち、不溶性画分を精製し（可溶性が多く取れそうな場合は可溶性画分）、ウサギに免疫しております。
これまでの経験上、ＷＢとＩＰには使えるのですが、免疫染色に使える抗体はまれです。

免疫染色に作りやすい抗体の作り方などあるのでしょうか？
ご教授お願いします。
素人考えですが、細胞の免疫染色をＰＦＡ固定で行っているので、抗原をＰＦＡ処理したほうが良いとかあるのでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.3563-6 - 2010/11/23 (火) 19:13:37 - は
>
> 賦活化は確かに組織の時はよくやっておりましたが、細胞ではやっておりませんでした。培養細胞で賦活化を試してみたいと思います。


ん？
今回の件は細胞染色だからパラフィン切片じゃないでしょ。
なので賦活化は関係ないと言える。
PFA固定をメタノールやエタノール、あるいは他の固定法に変えるのは試す価値あり。
でも強制発現細胞で染まらない抗体なら厳しいね。
しかし、タグ抗体では染色できているというポジコンはあるのかなあ。

(無題) 削除/引用
No.3563-5 - 2010/11/23 (火) 18:37:11 - 共有結合
みなさま
コメントありがとうございます。

そうなんです。
ＩＰに使えるのに染色に使えないことがよくあります。
過剰発現したタンパク質も検出できません。


抗原をＰＦＡ固定して免疫しても劇的な効果はなさそうですね。


賦活化は確かに組織の時はよくやっておりましたが、細胞ではやっておりませんでした。培養細胞で賦活化を試してみたいと思います。

Re: 免疫染色用の抗体用抗原作成 削除/引用
No.3563-4 - 2010/11/23 (火) 11:10:28 - 抗体
昔、体内のウイルス抗原を認識する抗体を学生さんに作ってもらいました。
マウスに抗原を投与し、常法通り、ハイブリドーマを作り、そのスクリーニングを免疫染色で行いました。大変手間のかかる実験でしたが、優秀な学生さんは見事に素晴らしく光る抗体を作ってくれました。
ご参考にしてください。

(無題) 削除/引用
No.3563-3 - 2010/11/23 (火) 02:16:05 - ATGC
PFA固定はアジュバンド混ぜたような効果があるって習った。だから抗体出来にくいときはいいかもしれないけど、普通にできるらべつPFA固定して免疫とかなくていいとおもう。

免染のとき、ふかつ化してる？。免染ではPFA固定で抗原決定基がマスクされたり、パラフィン包埋処理の影響で、そのままでは染まらない事のほうがむしろ多いよ。そのときは、中性ー弱酸性pH５　orアルカリ性pH9+キレート剤で加熱とか、protease K処理とか必要だったりする。スライドグラスは剥離防止処理というやつを使う。でないと処理がかなりきついので切片はがれる。ふかつ化の方法はネットでも免疫の実験本でも出てるからもしやるならそこで調べてください。抗体により至適条件（pHが高い方がいいものと低いほうがいいものがある。加熱も短い方がいいときと長くやらないとうまくいかないものとがある。それなんで条件振る必要もあるのでちょっとめんどう。

ふかつ化面倒なら、凍結切片がいいよ。一般的には凍結切片は免染成功率たかい。

(無題) 削除/引用
No.3563-2 - 2010/11/23 (火) 01:11:29 - は
IPにも使えるのに免染に使用できない・・・。
強制発現細胞をポジコンにしても染色能はないのかな？
すごく疑問。
そもそも染色の腕に問題はないのでしょうか？
固定法・時間を変えるとか。
細胞だと発現量低いかも。

当たり前のことを書くと、抗原部位は非変性状態で表層に露出している部分の方が良いけど、構造解析しない限りそれって想像の域ですね。まあN末かC末部分のある程度大きな領域を抗原にしておくのが普通ですかね。

ポリクロだしmulti-epitopeであればあるほど当たる（染まる）確率は高くなるでしょうが、変なクロスリアクトが増える危険性も同時に増えるからねえ。

PFA固定蛋白を免疫ですか？やったことあるけど全然ダメでした。
まあ回数こなしてないから否定はしませんが。エマルジョンとグチュグチュしてるからどうせ変性してるだろうと思う。
そんなことするより抗原部位を変えたり、数羽ずつ免疫した方が良いと思う。ホスト個体差アルアルですからね。

免疫染色用の抗体用抗原作成 削除/引用
No.3563-1 - 2010/11/22 (月) 23:54:15 - 共有結合
目的の抗体を得るために、通常私のラボでは、大腸菌で目的タンパク質の断片を過剰発現したのち、不溶性画分を精製し（可溶性が多く取れそうな場合は可溶性画分）、ウサギに免疫しております。
これまでの経験上、ＷＢとＩＰには使えるのですが、免疫染色に使える抗体はまれです。

免疫染色に作りやすい抗体の作り方などあるのでしょうか？
ご教授お願いします。
素人考えですが、細胞の免疫染色をＰＦＡ固定で行っているので、抗原をＰＦＡ処理したほうが良いとかあるのでしょうか？
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