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(無題) 削除/引用 No.3625-18 - 2010/12/21 (火) 08:31:27 - Actias ちょっと待ってくださいね。 > やはりBALB/Cは難しいんですね。129系統のマウスを購入して誘導を行ってみようかと思います。 ってことは、何のためにiPS 細胞を樹立するのでしょうか？ ヒトやマウスなら、 http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/search.php で売ってますから、iPS 細胞が欲しいだけなら、買えばいい。 「iPS細胞樹立に至る遺伝子の動態解析」とかなら、将来、どのツールを使うかまで考えた上で細胞を選ばないと、 「やっぱりあっちの株でやっておくべきだった」 になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.3625-17 - 2010/12/20 (月) 23:52:03 - cira そうですか、やはりBALB/Cは難しいんですね。129系統のマウスを購入して誘導を行ってみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3625-16 - 2010/12/18 (土) 00:08:04 - 名無し BALB/cを使ってられますが、他の系統は試されました？ BALB/cはＥＳの樹立も比較的難しいですし。 Ｆ１や129系統で試されてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3625-15 - 2010/12/17 (金) 16:36:38 - cira 各Factorは山中先生ものと同じです。シーケンスチェックを行って確認をしております。 またひとつ疑問だったのですが山中先生のaddgeneにて販売されているKlf4はGenebankのものと比べて、atgから頭数十bpが欠損していると思うのですが、わざとそういうコンストラクトにされているのでしょうか？ ご存知の方はいらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.3625-14 - 2010/12/14 (火) 23:11:19 - Actias 自分で取った遺伝子は、本当にYamanaka Factorと同じですか？ 市販でもOct3/4 にはisoform 1とisoform 2が出回ってますが、配列情報はあっても、意味まではきちっとかかれてないので、知らずに違うisoform を使ってしまってる場合があります。Myc もisoformがあります。 臓器から遺伝子を準備したということですが、本当にYamanaka Factor が発現していた臓器でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3625-13 - 2010/12/13 (月) 23:05:31 - kara 山中先生のプロトコールが必ずしもあなたの細胞に適しているとは限りません。 何度もインフェクションしている人はいるのかわかりませんが・・・・

(無題) 削除/引用 No.3625-12 - 2010/12/09 (木) 18:59:23 - cira MEFは凍結後すぐに感染させています。 プロトコールと異なるのは濃縮をしていること、感染を何度もしていることです。 あまり何度もする必要はないのでしょうか？ また、プロトコールではフィーダーもかなり薄いと思うのですが、増殖する場所が必要ということでしょうか？ やはりips細胞が出来ないのは細胞のせいでしょうか

Re:iPS細胞樹立 削除/引用 No.3625-11 - 2010/12/09 (木) 00:13:42 - i iPS ヒト線維芽細胞から樹立しましたが、出来るまではコツが分らず、苦労しました。 iPS細胞の樹立は元の細胞の状態が大きく影響すると思います。 MEFを使っているそうですが、だらだらと培養を続けていませんか？ 必ず、起こしてすぐの細胞を使うことが良いようです。継代数も若い方がいいと思います。 自分でベクターを構築されたそうですが、購入は無理なのでしょうか？ とにかく、いろんな意味でプロトコールに忠実にすれば出来ると思います。

(無題) 削除/引用 No.3625-10 - 2010/12/08 (水) 15:56:01 - ips やはり細胞によっても出来やすさが異なるのでしょう

(無題) 削除/引用 No.3625-9 - 2010/12/06 (月) 21:45:23 - cira 絶対にできる細胞とはどのようなものなのでしょうか？MEF細胞だと思っていたのですが。 またyamanakafactor以外になにかあるのでしょうか？ 勉強不足で本当にすみません＾＾；

(無題) 削除/引用 No.3625-8 - 2010/12/06 (月) 21:19:51 - atcc ええ、では違いますね。絶対にできるはずのポジコン細胞で手技的な確認をされることをお奨めします。Yamanaka factorではどうやってもできない細胞もあります。

(無題) 削除/引用 No.3625-7 - 2010/12/06 (月) 20:46:49 - cira ある一定のコロニーになると増殖が止まってしまっています。 培地は毎日交換しているのですが・・・。 アルカリフォスファターゼは陰性だったのでiPS細胞ではないと思いました。

(無題) 削除/引用 No.3625-6 - 2010/12/06 (月) 12:34:11 - atcc 普通、iPSのコロニーができてくると、それらは猛烈な勢いで増殖をはじめますが、まさかとは思いますが、培地交換が間に合ってなくて単に栄養不足で死んでるなんてことはないですよね？いったんでき出すと毎日の培地交換が必要になります。それともはがしてばらけさせるときの処理で死んでしまってるとか？それらがほんとにiPSのコロニーかどうかの確認は、されていないのですね。抗体が無くても、アルフォス陽性は簡単に調べられるので、まず確認した方がいいです。ただそれでもいったん蒔き直さないといけないわけですが。

(無題) 削除/引用 No.3625-5 - 2010/12/05 (日) 23:18:11 - cira ご意見ありがとうございます。 MEF細胞は妊娠14週齢のBALB/Cマウスから取得したものです。 ES細胞や山中博士の樹立したiPS細胞のフィーダー細胞として使用していたものです。 4因子はそれぞれマウスの臓器からRT-PCR法を用いて取得した配列を、pQMSCVというバックボーンベクターに乗せたものです。配列はGENEBANKおよびaddgeneの山中博士らのベクター配列と同じことを確認しております。 4因子を導入するとc-Mycが効いているのか明らかな増殖スピードの増加がみられるようになります、またレポーター遺伝子としてEGFPを発現するコンストラクトになっており、蛍光顕微鏡によって蛍光も観察できます。（ただし4因子なので1細胞に全てのファクターが入っているかはわかりませんが） Titer測定において、全てのウィルスベクターが正常に感染出来ることを確認し、MOIも1以上を保ってインフェクションしております（MEFはあまりMOIが高いと死んでしまうのですが） インフェクションした細胞のRT-PCR解析によって、4因子全てのmRNAの発現は確認しております（タンパクレベルでは抗体を購入してもらえないので確認できていません）。 4因子を導入するとコロニーらしきものは出来てくるのですが、ある一定期間を過ぎるとコロニー増殖は止まります。そのコロニーを新しいフィーダー細胞の上にpassしても増殖はしません。（いわいるリプログラムされていない中間体なのでしょうか？） お手数をお掛けいたしますが、現在iPS細胞の樹立を行っていらっしゃる方がいらっしゃいましたらアドバイスをよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3625-4 - 2010/12/05 (日) 21:59:44 - atcc iPSになるかどうかは確率的なもので、細胞に依存します。 レトロが入らない細胞は論外としても、 発現する細胞でもいくらやってもならないものもあります。 そのレトロで発現してるのが確かならば、 繊維芽細胞やkeratinocyteのように入りやすい細胞をポジコンとして進めた方がいいです。 レトロベクターの種類はまず関係ないです。

(無題) 削除/引用 No.3625-3 - 2010/12/05 (日) 21:11:34 - ami どこがうまくいかないのか、どこがうまくいっているのか(どういう根拠でうまくいっていると考えられるのか)。 ここまでの情報では、単にMEFがなんかおかしいんじゃないの？っていう可能性すら除外できない。自分でどこまで考えて、どういう可能性が考えられて、どういう可能性が除外できるのか。

(無題) 削除/引用 No.3625-2 - 2010/12/05 (日) 20:57:21 - Actias そのベクターはどうしました？ うまくいっているところからのもらい物でしょうか？自作でしょうか？ もらえるなら、もらってやったほうがいいでしょう。 もし分子生物学会に行くなら、企業ブースとかNBRPの展示で聞くといいです。しがらみないし。 うまくいかないというのは、どの段階まででしょうか？ タンパク発現は、確認できるのでしょうか？

iPS細胞樹立 削除/引用 No.3625-1 - 2010/12/05 (日) 15:00:35 - cira こんにちは、いつも勉強させていただいております。 現在iPS細胞の樹立に取り組んでいるのですが、どうしてもできません。 方法はMEF細胞(BALB/C)へプロトコール通りにレトロウィルスで4因子を導入したり、濃縮して導入したりも行いました。 また数回に分けてインフェクションをさせたり、inhibitorである2iを添加したり、様々な方法を試しましたが出来ません。 プラスミドのシーケンスは何度も確認し、ウィルの生産なども問題ないようです。 どなたかいいアイディアをおもちのかたはいらっしゃいませんでしょうか？

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