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(無題) 削除/引用 No.366-7 - 2009/04/30 (木) 21:05:49 - AP →アプライ量が少なすぎて見えないのか、制限酵素処理と精製段階でロスしているのかがよくわからなくなりました。 (ちなみに…制限酵素処理前はバンドが確認できています) EtBr染色で蛍光検出するばあい、一バンド当たり1 ngくらいが検出限界です。実用上はその10倍以上はほしいところです。反応に使用したDNA量が分かっていれば、どれくらい乗せれば見えるかは予測できるし、あらかじめちゃんと見当をつけてから泳動します。十分見える量をestimateして泳動したのに見えなかったというのなら実験系になにか問題があるのでしょうけれど、ロスしたのかサンプル量が少ないのかわからんといっているようでは話になりません。 >そのライゲーション産物を形質転換に用いた以外の残りを一応ライゲーションさせたところこちらもバンドが見えませんでした。 >形質転換終わってからその事実が判明して焦っています。 >やはりバンドが確認できていないということは失敗なのでしょうか？ バンドが見えていないから即失敗とは言えません。形質転換には正しく環状化したプラスミドが、EtBrで検出できる量の1/1000もあれば十分だからです。 私は、インサート、ベクターとも5-20 ngくらいのスケールでやっています。ligation産物からサンプリングして電気泳動はしませんし、しても見えないでしょう。そもそもligation産物を泳動して得られる情報はないです（ligaseの完全失活が疑われるような場合ならともかく）。

(無題) 削除/引用 No.366-6 - 2009/04/30 (木) 20:40:59 - Pumpkin >質問するのも恥ずかしいレベルですが �@ ご自分でもお分かりのようですが、ライゲーションの時に濃度すら測っていないのですか？そこで十分な量がなければ、電気泳動しても見えないでしょう？まったく無いのに、ベクターとのライゲーションに持ち込んでいるのですか？ �A �@と同じですが、電気泳動で確認できる量をアプライしているのですか？ しっかりとステップステップで確認するべきですよ・・・

(無題) 削除/引用 No.366-5 - 2009/04/30 (木) 19:38:55 - 未熟者 こんばんは。 今日ライゲーションを行ってみました。 プレートのほうは明日には結果が出るはずです。 少し気になったことがあったのでまた質問させてください。 �@制限酵素処理後の断片を一応電気泳動させたのですが、バンドが見えなかったということ →アプライ量が少なすぎて見えないのか、制限酵素処理と精製段階でロスしているのかがよくわからなくなりました。 (ちなみに…制限酵素処理前はバンドが確認できています) �Aライゲーション反応を行い(TOYOBO Ligation high Ver.2使用、16℃、2h) そのライゲーション産物を形質転換に用いた以外の残りを一応ライゲーションさせたところこちらもバンドが見えませんでした。 形質転換終わってからその事実が判明して焦っています。 やはりバンドが確認できていないということは失敗なのでしょうか？ 質問するのも恥ずかしいレベルですが…どうかよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.366-4 - 2009/04/23 (木) 14:41:38 - AP >1. そのことを知らなかったのでゲル切り出しの際に、泳動後、EtBr染色し、そのごく一部をUV照射し、他の部分はアルミで遮蔽する方法で行いました。 この場合でもチミンダイマーの影響はあるのでしょうか？ ごく一部以外遮蔽しているのだから、大部分のDNA分子には影響ないということでしょう。ごく一部のDNA分子にチミンダイマーが形成されて、その分、全く当てなかったよりも劣化があるということがあるかもしれませんが、全体の量から考えて、そういうのが少々混じっている分には無視できるんじゃないですか。程度の問題で、紫外線をちょっとでもあてると全然だめという、全か無かではありえないです。「呪い」とか「たたり」じゃないんですから。 >2. また、私がライゲーションするインサートは2つのPCR断片をそれぞれ増幅し、PCRによって連結させたものを使う予定です。 各断片の増幅自体からUVを全く当てないで作成しなおすところまで戻るか、 PCRで連結させたところからUVを全く当てないでゲル切り出しを行うところをやり直すか迷っています。 チミンダイマーができると、大腸菌（一般的に組換え実験で使うRecA-）では複製ができなくなりますので、耐性のコロニーとして生えてきません。 PCRの鋳型の場合は、どうなるか実際的なことはわかりませんが、教科書的な複製機構知識からの類推で、 ・チミンダイマーで生じた鋳型の歪みがpolymeraseの進行を妨げて、そこで伸長が止まる。 ・チミンダイマーが1塩基分の鋳型として使われ、塩基置換プラス一塩基欠失のmutationが起こる。 だとしても、大部分のDNA分子を保護しているのですから、それで十分収穫できるはずで、このことが原因で、全く取れなかったというようなことは起こらないと思います。

(無題) 削除/引用 No.366-3 - 2009/04/22 (水) 01:09:59 - おお チミジンダイマーはよくAPさんが説明してましたので過去ログを 見られるといいかと思います。基本的にホイルで覆っている部分 についてはほぼ大丈夫だと思います。 UV長波長でもこれは形成されるので長波長だから安心ということは ないと思います。 �Aについては気持ち悪いのであれば初めからやるのがいいと思いますが、 現在てもとにあるPCRフラグメントは一度ライゲーションすればいいかと おもいます。 それでコロニーができないとなると、アルミで覆っているのでUV以外 の原因も考へないといけないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.366-2 - 2009/04/21 (火) 19:35:44 - ~ これに詳しい人っているのですかね？ UVランプの波長パターン、ゲルの厚み、フラグメント長、時間などによって影響が異なるでしょうから、 やってみて結果次第となると思いますけど。 アルミで遮光していれば、問題ない状態だと思います。 (横からどれくらい漏れこんでいるのか分かりませんが) 1 >この場合でもチミンダイマーの影響はあるのでしょうか？ あたった部分には影響はあるでしょうけれども、 アルミで遮蔽されている部分の比率が多いでしょうから、あまり気にすることは無いと思いますけど。 ２ 私ならば、今あるサンプルはそのまま進めてライゲーション、トランスフォーメーションに持って行き、 それで生えなかった時用に、初めのPCRからやっておきますけど。

ライゲーションとチミンダイマー 削除/引用 No.366-1 - 2009/04/21 (火) 18:38:24 - 未熟者 こんにちは。 このフォーラムでいつも勉強させてもらっています。 これからライゲーションを行いたいのでいろいろ勉強しているのですが、 気になることがあったので教えていただきたいです。 前のトピックでライゲーションを行うベクターやインサートにチミンダイマーがあると形質転換効率にかなり影響するということを知りました。 �@そのことを知らなかったのでゲル切り出しの際に、泳動後、EtBr染色し、そのごく一部をUV照射し、他の部分はアルミで遮蔽する方法で行いました。 この場合でもチミンダイマーの影響はあるのでしょうか？ �Aまた、私がライゲーションするインサートは2つのPCR断片をそれぞれ増幅し、PCRによって連結させたものを使う予定です。 各断片の増幅自体からUVを全く当てないで作成しなおすところまで戻るか、 PCRで連結させたところからUVを全く当てないでゲル切り出しを行うところをやり直すか迷っています。 研究室の方に聞いても、詳しい方がいらっしゃらず困っています。 初歩的かもしれませんが、どうかよろしくお願いします。 説明不足でしたら、連絡いただければ説明します。

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