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His-tagのIn-gel検出について トピック削除
No.3665-TOPIC - 2010/12/10 (金) 15:56:57 - ひすばん
InvitrogenのKitを用いて、ウェスタンを行わず、SDS-PAGEから直接Hisタグ融合タンパクのバンドを確認する実験を行っています。

【手順】
@:電気泳動
A:エタorメタ+酢酸bufferにて固定
B:超純水にて洗浄×2
C:Kit在中のHisタグ蛍光検出bufferにて反応開始
D:リン酸bufferにて洗浄×2
E:CCDカメラにてバンドを確認
なのですが、バンドが確認できませんでした…。


【プロトコール】によれば、
@:UVライトボックスにゲルを置くだけでは可視不可である。
A:UVランプ付のCCDカメラを用いること。
B:ただし、UVランプが無くてもレーザーベースのCCDスキャナ560nm〜610nmのものも用いることができる。
C:あと、場合によればUVライトボックス(310nm〜)に長時間ゲルを露出うする必要がある。
が、確認方法のようです。


↑この記載を理解したうえで、自室のCCDカメラについて電話で問いただしたところ、『カメラの励起光は470nmなので、560nm〜の蛍光検出は不可能にちかい』とのことでした。少なくともプロトコルのBが自室ではムリということは解かりましたが、@とCは何となく矛盾しているのでは?と思えて止みません。


宜しければ、似た経験から得たコトやご意見があればお聞かせ下さい。
今後は、プロトコルのCを実践しようと考えています。
 
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検出 削除/引用
No.3665-2 - 2011/02/06 (日) 11:30:54 - His
【プロトコール】によれば、
@:UVライト(302 nm)で励起し、高感度カメラが必要
C:UVライト(365 nm)の場合は励起効率が下がるので
(302 nmに比べて)長時間ゲルを露出する必要がある。

だと思いますが、如何でしょうか?

His-tagのIn-gel検出について 削除/引用
No.3665-1 - 2010/12/10 (金) 15:56:57 - ひすばん
InvitrogenのKitを用いて、ウェスタンを行わず、SDS-PAGEから直接Hisタグ融合タンパクのバンドを確認する実験を行っています。

【手順】
@:電気泳動
A:エタorメタ+酢酸bufferにて固定
B:超純水にて洗浄×2
C:Kit在中のHisタグ蛍光検出bufferにて反応開始
D:リン酸bufferにて洗浄×2
E:CCDカメラにてバンドを確認
なのですが、バンドが確認できませんでした…。


【プロトコール】によれば、
@:UVライトボックスにゲルを置くだけでは可視不可である。
A:UVランプ付のCCDカメラを用いること。
B:ただし、UVランプが無くてもレーザーベースのCCDスキャナ560nm〜610nmのものも用いることができる。
C:あと、場合によればUVライトボックス(310nm〜)に長時間ゲルを露出うする必要がある。
が、確認方法のようです。


↑この記載を理解したうえで、自室のCCDカメラについて電話で問いただしたところ、『カメラの励起光は470nmなので、560nm〜の蛍光検出は不可能にちかい』とのことでした。少なくともプロトコルのBが自室ではムリということは解かりましたが、@とCは何となく矛盾しているのでは?と思えて止みません。


宜しければ、似た経験から得たコトやご意見があればお聞かせ下さい。
今後は、プロトコルのCを実践しようと考えています。

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