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普通のトランスフェクションでいいです 削除/引用 No.367-7 - 2009/04/23 (木) 22:34:18 - Tb > 当方はウイルス導入をしたことがなく、 いや普通のプラスミドのトランスフェクションでいいですよ。 キットを使うならInvitrogenのpcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kitあたりがお手頃でしょうか（ざっとカタログ見ただけなので保証の限りではありません）。でも、本当に細胞に発現させれたのかとか見ることになると、確かに手間がかかっていきますね。

ありがとうございました。 削除/引用 No.367-6 - 2009/04/23 (木) 21:37:18 - POM ありがとうございました。 Tbさん＞たしかにtransfectantを作るのはいいと思うのですが、当方はウイルス導入をしたことがなく、結果染まらなかったとなるとかなりモチベーションを失ってしまう危険があるので、まずはポリクロで一度試して細胞集団を見てみたいと思います。いけそうならWB、FC両用のモノクロでやってみようと思います。 CANIさん＞ホモロジーは結構高いですので、期待はしているのですが。やっぱり実際はやってみないとわからなさそうですね。 また教えてください。

(無題) 削除/引用 No.367-5 - 2009/04/22 (水) 09:23:22 - DNAI �@やってみないとわかりません。 �Aコンフォメーションを特異的に認識するmAbの場合、FACSには使えてもWBには使えないケースが多々あります。 �Bホモロジーが高い＝タンパクの構造が類似しているので、抗体の交叉の可能性は高くなります。また、全体のホモロジーが低くても、ファミリー特異的な構造（ドメイン）が保持されていれば交叉するかもしれません。 pAbの場合、ホモロジー80％以上だとほとんど交叉する印象があります。mAbならばスクリーニングを工夫して特異的な抗体にすることは可能ですが。 抗体の認識特異性、ターゲットのホモロジー（vs ヒト、マウス）の情報があればもう少し具体的な話が出来ると思います。

横から質問です 削除/引用 No.367-4 - 2009/04/22 (水) 07:34:54 - CJ 横から質問をしてすみません。 あまりホモロジーが低いとＩＨＣでクロスしない印象があるのである程度保存配列を考えて抗体を買っているのですが、何％まではクロスする、とかいった感じの経験則みたいなものを持っておられる方はいますでしょうか？ あと、あるポリクロ抗体はあるタンパクの領域のうち、配列が既知のすべての哺乳類で１００％保存されたペプチド（１０アミノ酸）を抗原にしていると書いてあったのですが、にもかかわらずＩＨＣをするとラットやマウスで強く染まり、ウサギではちょっと弱くなって、サルではほとんど染まらない、という結果を得たことがあります（別の抗体ではすべての動物が同様にきれいに染まるので、固定はどれも良好であると考えています。）。このような経験をした方はおありでしょうか？

でもその前にまずは犬の細胞が染まるかどうかから 削除/引用 No.367-3 - 2009/04/22 (水) 04:35:11 - Tb でもせっかくtransfectantを作っても、「染まりませんでした。終わり。」ではくたびれもうけですから、まずは犬の細胞にポジティブに染まる集団がいるかどうかですね。ヒト・マウスからどれくらいの明るさが期待されるのでしょうか？はっきりと集団が分かれるのが見られそうですか？また、そまる集団が確認できたら、もともと細胞を分画する予定のようですし、プラス、マイナス集団にわけて、RT-PCRすることにより、mRNAの発現がその抗体での分画に一致することをみれば、安心できます。

mRNAの配列がわかっているのなら 削除/引用 No.367-2 - 2009/04/22 (水) 02:53:29 - Tb RT-PCRができるということはmRNAの配列はわかっているということですよね？でしたら、exprssion vectorにとって、その抗原を発現していなさそうな適当な培養細胞に発現させ、その抗体で染まるかどうかをみるのが一番確実だと思います。 ところで、その抗体はマウスあるいはヒト細胞では、FACSでもWesternでも使えることがわかっているのですか？モノクロですか、あるいはポリクロですか？個人的にはポリクロでのFACSはリコンビナントタンパクでアフィニティー精製したもの以外、ちょっと信用できないと思っています。

交差性の判定 削除/引用 No.367-1 - 2009/04/22 (水) 01:06:05 - POM こんにちは。いつもお世話になります。 ある細胞をFACSで2種類の表面抗原を用いて、両方ポジティブな分画で抽出したいと考えております。ただ、用いる細胞が犬なので、1種類の表面抗原については、抗体が市販されておらず、困っております。RT-PCRを用いた結果、mRNAの発現は確認しております。ヒトとマウスに使える抗体はあるのですが、実際、これらの抗体が交差するかどうかを判定する方法がわかりません。質問は以下の3つです。（勉強不足といわれるかもしれませんが・・・） �@WBを一度試してみるのがいいかと思っているのですが、それで当たれば交差していると判定していいのでしょうか。交差判定の正しい判定方法をご存じの方がいれば教えていただけますでしょうか。 �AWBでOKだからといって、FC用のものも交差すると考えるのは安易すぎると思うのですが、どうでしょう。 �B抗体が交差することと、アミノ酸配列や塩基配列のﾎﾓﾛｼﾞｰは何か関係があるのでしょうか。 以上です。よろしくお願いします。

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