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別トビの方が良いのかも知れませんが 削除/引用 No.3675-17 - 2010/12/15 (水) 23:52:59 - 笑い男 　金属（Cu）で発現誘導させたタンパク質を、金属（Ni）で精製するというのも、何だか不思議な気分がしています。 　メーカーがそういうベクターを販売しているのだから、特にトラブルが発生しないのかもしれませんが・・・・ 　このシステムの使用経験のある方で、トラブル経験があったとか、不具合無く使えています、等のコメントを返して頂きたく質問いたしました。 HisTagさんへ： 　Ni-NTAタイプのQIAGENでは収量が上がらず、His-tagとの結合は強いが Niが外れやすいNi-IDAタイプのWAKOで収量が改善されたとのコメントから、 Cuが悪さをしているのかなー？っと感じた訳です。 　だって誘導の為に添加したCuは、発現してきたHis-tagに強く結合しちゃうよねー？しかもNiよりも強固にHis-tagと。 　だったら、一回目の精製で�@銅イオンをトラップする程度のEDTAを加えてからNTAタイプでで精製する、�A銅イオンが全て析出する程度の還元剤を加えてからNTAタイプで精製する、などで収量と精製度を改善できるのではないかと考えました。　ただの思い付きですけどね。しかもイミダゾールを除去するという本来の目的は解決してないですが・・。 　あと、希釈してから２回目のNiゲルに通すこと（おおさん案）を採用されたのであれば、ぜひとも２回目のQIAGENとWAKOの比較も報告して頂きたいなっと思っております。

(無題) 削除/引用 No.3675-16 - 2010/12/15 (水) 17:22:24 - HisTag すべて謎が解決できました。 迅速な対応に感謝します。いろいろアドバイスして頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3675-15 - 2010/12/15 (水) 17:18:26 - おお >[Re:14] HisTagさんは書きました : > >おおさん > > 解答ありがとうございます。 > > >精製後のものを直接透析して，そのまま使えないのですか? > > 精製後の溶出液にまだ夾雑タンパクが含まれているので，もう一度カラムを通して精製しようと思ったので，そのままは使わないことにしました。説明不足ですいません。 了解です。同じ性質のカラムだと劇的に夾雑物はのぞけませんが、いくらかはましになる場合もあります > > なぜ薄いものをさらに薄めてカラムにのせるのですか？ イミダソールを薄めてカラムに吸着できるようにするためです。このほうほうは別に蛋白の濃さには理論的には依存しません。

(無題) 削除/引用 No.3675-14 - 2010/12/15 (水) 16:56:46 - HisTag >おおさん 解答ありがとうございます。 >精製後のものを直接透析して，そのまま使えないのですか? 精製後の溶出液にまだ夾雑タンパクが含まれているので，もう一度カラムを通して精製しようと思ったので，そのままは使わないことにしました。説明不足ですいません。 >精製後のものが薄いのなら、カラムにのるようにじゅうぶん薄めてカラムにのせ少量の溶出液で溶出し透析すれば、ともおもいますが、、、、 なぜ薄いものをさらに薄めてカラムにのせるのですか？

(無題) 削除/引用 No.3675-13 - 2010/12/14 (火) 13:06:06 - おお >[Re:12] HisTagさんは書きました : > みなさん参考になる意見ありがとうございます。 > > とりあえずアミコンによる濃縮とバッファ交換を行わずに、精製後のものを直接透析して，再度カラムにかけ，少量のimidazoleで溶出してこようと思います。 精製後のものを直接透析して，そのまま使えないのですか? 精製後のものが薄いのなら、カラムにのるようにじゅうぶん薄めてカラムにのせ少量の溶出液で溶出し透析すれば、ともおもいますが、、、、 > また質問なのですが，100uL〜500uLの小量サンプルを透析する際，おすすめの商品ありますか。経験ある方いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。 http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=3406

(無題) 削除/引用 No.3675-12 - 2010/12/14 (火) 12:55:45 - HisTag みなさん参考になる意見ありがとうございます。 とりあえずアミコンによる濃縮とバッファ交換を行わずに、精製後のものを直接透析して，再度カラムにかけ，少量のimidazoleで溶出してこようと思います。 また質問なのですが，100uL〜500uLの小量サンプルを透析する際，おすすめの商品ありますか。経験ある方いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3675-11 - 2010/12/14 (火) 11:01:53 - とおりすがい この手の遠心濃縮で、遠心力をマニュアルの半分くらいにして頻繁に液を混ぜてやると膜への吸着が多少ましになることがあります。

(無題) 削除/引用 No.3675-10 - 2010/12/14 (火) 08:51:58 - aimar 透析が出来ない理由があるのでしょうか。 アミコンウルトラのフィルターに吸着しちゃってるのかもしれませんね。最後に吸い上げる時、これまで以上にしつこくピペッティングするとか。 あるいは30k>10kですが、多少はスルーしていく気がするので、そのロスもあると思います。 いろいろ考えると透析がいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.3675-9 - 2010/12/13 (月) 22:12:40 - おお >透析すれば十分ものはあるんだから，濃縮しなくてもいいんではないかということですか。 そうです。 >モノを濃くすることで，濃縮とバッファ交換でロスが少なくなり、回収率が上がるということでよろしいですか ものが濃いので濃縮の必要がないということです。 カラム精製後直接透析に持っていけばいいとおもえない理由があるんでしょうか。 アミコンウルトラなど遠心して濃縮するタイプのものはものによっては回収率を損なうものがあります。

(無題) 削除/引用 No.3675-8 - 2010/12/13 (月) 21:41:49 - 類似 私も類似のところで困っています。非特異的な吸着によって、収率が悪くなっていると判断しています。 この場合、 １）塩濃度をかなり上げる。 ２）支障のない範囲でマイルドな界面活性剤を入れる。 この両方かどちらかをトライということになると思います。ろえきにモノがないことも確認。もしくは使っている膜の適合性とかもあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3675-7 - 2010/12/13 (月) 21:29:10 - shima 以前His-tag付きたんぱくの精製を行っており、イミダゾールで溶出していました。 自分は、カラムを使って行っていたのですが、 系の小さいカラム（なるべく細いもの）を使うと、トラップ時間が長くなり、精製度が格段に上がりました。 ちょっとした工夫でしたが、格段に上がりました。 もし、お心当たりがあれば、どうぞお試しください。 Buffer交換は、自分も透析で行っていました。 濃縮は、ミリポアのフィルターを使ってたんぱく濃縮ができる物があります。 自分は、この方法で、濃度も精製度も満足なたんぱくを得ていました。

(無題) 削除/引用 No.3675-6 - 2010/12/13 (月) 19:27:22 - HisTag >おおさん 解答ありがとうございます。１度簡単な予備実験しようと思います。 >もう一度Niカラムにつけ500mMイミダゾールかEDTAでオープンカラムで慎重に落とすと濃くなると思います。Niカラムでなくてもイオン交換でもいいとおもいます。バッチ吸着で小容量でリリースするのもいいかもしれません。 モノを濃くすることで，濃縮とバッファ交換でロスが少なくなり、回収率が上がるということでよろしいですか。 >PBSで透析であればバイチにいれる10倍濃度ほどでもいいわけですよね。今の状況で1/10000の濃度で使うんだったらそのままPBSなどで透析しても十分の濃度の物が得られるんじゃないですか? すいませんが，ここをうまく理解できません。要するに、透析すれば十分ものはあるんだから，濃縮しなくてもいいんではないかということですか。 >それとも透析で回収率が悪いのでしょうか? 透析を行っていません。下記のanimarさんへの解答でも記入しましたが、アミコンで濃縮とバッファ交換を行っています。 >物によっては凍結乾燥(完全な乾燥でなくてもいいかも)、硫安沈殿、アセトン沈殿とか使える場合もあります。 タンパク変性したくないので，極力避けたいです。 >透析や濃縮で精製率はあまり期待できないと思うんですが回収率が悪いということですよね。 そうです，間違えました。回収率が悪いということです。

(無題) 削除/引用 No.3675-5 - 2010/12/13 (月) 19:16:34 - HisTag >う-んさん 解答ありがとうございます。 buffer交換は透析ですか。私も以前にbuffer交換を透析で行い，マイクロコンを使って濃縮したことありますが，回収率がよくありませんでした。回収率15%はいい方なのでしょうか。 培地はSf 900II SFMを使っています。一般的な方法だと思いますが，CuSO4使って発現誘導かけて，コンディション培地を回収し，遠心してきた培養上清に，Ni agarose（WAKO）を加え，一晩低温室でRockingします。それをカラムに流して、イミダゾールで抽出してきています。 私も以前に濃度検討したWash画分になぜか大量にものが溶出されることがありましたが、QIAGENのレジンをWAKOに変えたらだいぶましになりました。 >aimarさん 解答ありがとうございます。 >どの段階でロスするのでしょうか。透析してるんですよね？ バッファー交換でロスしています。透析していません。アミコンウルトラ-4で濃縮とバッファ交換しています。 プロトコールは，まず溶出バッファ（200mM imidazole/PBS）を0.4mLくらいまで濃縮し，それをPBSで10倍希釈を3回行っています。 >あとアミコンウルトラのサイズはちゃんと正しいですか？ ものは大きさ30kDaで，アミコンは10K deviceを使用しているので，大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.3675-4 - 2010/12/13 (月) 16:45:02 - おお >[Re:1] HisTagさんは書きました : > > またBuffer交換する際，200mM imidazole/PBSをPBSで100倍希釈し，反応系に入れるのはせいぜい100分の1くらいなので、哺乳動物細胞に添加するアッセイ系には0.02mMのイミダゾールが入ることになります。念のため，同濃度のイミダゾールを入れることで対応は可能と考えていますが，これで大丈夫でしょうか。 www.inchem.org/documents/sids/sids/288324.pdf ラットのプライマリーの肝細胞で1mg/mlで50%の細胞が生き残ったと書かれています。１度簡単な予備実験をされるといいかとおもいます。 もう一度Niカラムにつけ500mMイミダゾールかEDTAでオープンカラムで慎重に落とすと濃くなると思います。Niカラムでなくてもイオン交換でもいいとおもいます。バッチ吸着で小容量でリリースするのもいいかもしれません。 PBSで透析であればバイチにいれる10倍濃度ほどでもいいわけですよね。今の状況で1/10000の濃度で使うんだったらそのままPBSなどで透析しても十分の濃度の物が得られるんじゃないですか?それとも透析で回収率が悪いのでしょうか? 物によっては凍結乾燥(完全な乾燥でなくてもいいかも)、硫安沈殿、アセトン沈殿とか使える場合もあります。 >透析してからの濃縮の方が精製率高いなどがありましたらお教えください。 透析や濃縮で精製率はあまり期待できないと思うんですが回収率が悪いということですよね。

(無題) 削除/引用 No.3675-3 - 2010/12/13 (月) 15:54:38 - aimar どの段階でロスするのでしょうか。 濃縮段階かbuffer交換段階か。 >Buffer交換する際，200mM imidazole/PBSをPBSで100倍希釈し というのは透析してるんですよね？ただ、bufferを加えただけ？ Niカラムで精製→透析→濃縮 という流れで以前はやってました。 あとアミコンウルトラのサイズはちゃんと正しいですか？

(無題) 削除/引用 No.3675-2 - 2010/12/13 (月) 15:48:23 - う-ん 私はbuffer交換は透析で行っています。 アミコンでの限外ろ過はリカバリーのロスが多い印象です。 話はそれますが、昆虫細胞の培養上清というとSf-900IIかSf-900IIIでしょうか？ この上清からNiを利用したaffinity 精製は効率が非常に悪く、難しくありませんか？ 参考までにどのようにやられておられますか？ 私はちなみに上清を透析後、Ni-affinity 精製を行っていますが、Niに結合しないものが非常に多く困っています。

Hisタグ付きタンパクの精製および濃縮について 削除/引用 No.3675-1 - 2010/12/13 (月) 15:02:20 - HisTag もしわかる方がいらっしゃいましたらご教示ください。 私は，C末端にMyc-Hisタグ付きの分泌タンパクを昆虫細胞にて発現させ，Ni agarose (wako) で精製しています。最終的にこの精製タンパクは，哺乳動物細胞にある濃度で振りかけ，あるタンパクが活性化されるかみようとしています。 200mM imidazole/PBSで溶出してある程度の純度のタンパク質を得ることはできたのですが，アミコンウルトラ-4（MILLIPORE）による濃縮およびBuffer交換（imidazoleからPBS）で手こずっており，精製率が低いです。このような場合、どうやって濃縮およびBuffer交換をしたら改善されるでしょうか。別の効果的な方法であったり，透析してからの濃縮の方が精製率高いなどがありましたらお教えください。 またBuffer交換する際，200mM imidazole/PBSをPBSで100倍希釈し，反応系に入れるのはせいぜい100分の1くらいなので、哺乳動物細胞に添加するアッセイ系には0.02mMのイミダゾールが入ることになります。念のため，同濃度のイミダゾールを入れることで対応は可能と考えていますが，これで大丈夫でしょうか。 同様の経験をお持ちの方、また知識のある方、いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。

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