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沈殿は見えました。 削除/引用 No.3698-6 - 2010/12/21 (火) 12:56:03 - 310 ご報告が遅れて申し訳ありません。LPAはμgオーダーであれば、目に見える沈殿を作ってくれました。これをプレートエタ沈に用いれないかと思い、1000xg 45min.遠心してひっくり返して、100rpm程軽く回したところ、1ug以上はすべて脱落しました。はがれやすいとプロトコールに書いてあっただけのことはあります。 200ng位ですとあるんだか無いんだか分からないような何かが底に張り付いたままはがれなかったので、この量でシーケンス反応産物精製に用いましたが、脱落もせずシグナル増加も見られず普段と変わった点はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3698-5 - 2010/12/17 (金) 14:56:59 - 310 ちょこ様、中年様、BlueHornet様 教えていただきありがとうございました。 ＞ちょこ様 >あまり時間を長くすると、重合度が高くなってしまいます。 >そうすると、アルコール沈殿のあとの再溶解がしづらくなる >印象があります。 ちょこ様のお答えを聞いて、即、重合をやめました。液体は中年様のおっしゃるように ＞液面に立つ波がチューブの壁を叩いてペタペタ音がする感じ。 でした。十分後も数十分後もデシケータで脱気した後も、同じように見えました。 ＞BlueHornet様 ＞心配せずに次のステップに進んでみて下さい。 エタ沈は終わり、現在0.3mM（pH7.8前後）程度のトリス水溶液30mlほどで溶解中です。1時間程度シェーカーに入れていたところ、半分溶けました。 エタノールを加えた際、白濁したので上清を新しいチューブに移して遠心してみましたが、非常にわずかな量しか取れなかったので、廃棄しました。遠心しないプロトコールだったので多少不安でしたが、遠心不要なことがよく分かりました。 エタノール洗浄で大きい沈殿がスポンジのような固さなのを見て、webにあった”squash pellet"の意味がやっと分かりました。 皆様、助けていただきありがとうございました。エタ沈の結果が出ましたら、ご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.3698-4 - 2010/12/17 (金) 12:59:06 - BlueHornet 310さん、いつもご苦労様です。 僕も日常的にGeneScanをABI310で行っているので、310さんの立てたトピックをいつも参考にさせてもらっています。 さてLPAの件ですが、僕が実際にLPAを作成した時は、以前のトピックで中年さんが挙げて下さっていた原報どおり（Gaillard, C. and Strauss, F. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 378）で全く問題ありませんでした。310さんの表現しておられるとおりの流動性のかなり高いとろっとした溶液になりましたよ。心配せずに次のステップに進んでみて下さい。 310さんの挙げておられる http://www.uvm.edu/~tpdelane/lab/protocols/LinearPolyAcryl.htm ではLPAの終濃度は0.5%ですが、僕は原報どおりの0.25%で使用しています。

(無題) 削除/引用 No.3698-3 - 2010/12/17 (金) 10:39:43 - 中年 とろっとしてれば十分だと思います。チューブを振ると、液面に立つ波がチューブの壁を叩いてペタペタ音がする感じ。

多分それで良いはずです 削除/引用 No.3698-2 - 2010/12/17 (金) 09:22:45 - ちょこ あまり時間を長くすると、重合度が高くなってしまいます。 そうすると、アルコール沈殿のあとの再溶解がしづらくなる 印象があります。 冬だからということでやや長い時間重合させるとしても 程々にしておかれるのが宜しいかと思います。 重合後にどれぐらいとろっとしていたかはもう忘れてしまい ました。でも、アルコールと塩を入れて溶解度を下げたとき に析出したらよいのであって、重合時に固まる必要はないの ではないかと思います。 まずは、水100 uLに作ったLPAを適当量入れてから、ペレット ができるかどうかアルコール沈殿してみてはどうでしょう？

直鎖状アクリルアミド(LPA)の作成 削除/引用 No.3698-1 - 2010/12/17 (金) 08:57:04 - 310 下記の手法で直鎖状アクリルアミド(LPA)の作成を行っています。 http://www.uvm.edu/~tpdelane/lab/protocols/LinearPolyAcryl.htm ビスアクリルアミドのない直鎖の結合なので、一般的なアクリルアミドゲルと比べ、固まらないように思ってますが、あまりに流動性が高い（とろっとした液体）ため指定の時間が経っても、怖くて次のステップに進めません。 一回作れば、相当持ちそうなので、APSとTEMEDは隣のラボから頂いています。APSが溶解しにくくマニュアルの10％を5％にして、入れる量を倍にした以外、特に気付いた点はありません。 LPAというのはどのような形状になるか分かる方、特に重合の目安をお教えください。

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