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(無題) 削除/引用 No.37-7 - 2009/02/19 (木) 10:34:38 - 組織 熱処理よりもプロテアーゼ処理の方がよく染まる蛋白抗原はたくさんあります。どんな抗原であれ、酵素処理を試しておいて損はないと思います。 他の方もいわれていますが、抗原によってはトリプシンやペプシンなど、ProK以外の酵素も有効です（コラーゲンにはペプシンが効果的でした）。また使用濃度や反応時間によってもかなり染色結果が変わるので、うまくいかない時は反応条件を振ってみるといいと思います。ただ経験上ProKが一番汎用性が高く、かつ室温で反応できて楽なので、たいていProKを使ってますね。

(無題) 削除/引用 No.37-6 - 2009/02/19 (木) 02:29:59 - 名無し ホルマリン固定で架橋された状態にあるので、protease Kでペプチドが切れてもバラバラになってみんなどっかに行ってしまうことは一般的には起こりにくいとおもいます。蛋白質の免疫染色の際、蛋白質をすこし壊して、抗原への抗体のアクセスをしやすくするのにプロテアーゼを使っている人はいます。モノクローナル抗体で運悪くエピトープ部分に切断が入ったりすると良くない影響が出てしまうかもしれませんが、標本中の全てのエピトープで起こるということはないと思うので、残った部分と反応すれば検出はできるように思います。経験的にはクエン酸溶液中で電子レンジにて沸騰させるのが、がうまく行くことが多かったのでよくやりました。あと抗DNA抗体ならクロマチン構造をあるていど崩すという意味でProKよりリジンなど塩基性アミノ酸の横をよく切るということでトリプシンの方がもっといいかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.37-5 - 2009/02/18 (水) 18:26:25 - かた ありがとうございます。 あと。タンパクを抗原としている場合は、プロテアーゼだとまずいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.37-4 - 2009/02/17 (火) 11:06:19 - 組織 >[Re:1] かたさんは書きました : > ヒト脳組織の、パラフィン切片を用いた免疫染色で、賦活化を行うときの選別法がわかりません。 賦活化法の選択はケースバイケースで、試してみないとわかりません。抗原によって、酵素処理（プロKやトリプシン）が良かったり、熱処理（マイクロウェーブ、オートクレーブ）が良かったりします。賦活化しない方がきれいに染まる抗原なんかもあります。新しい抗体を使う時は、少なくとも酵素処理、熱処理、賦活化なしの3通りを試されることをお勧めします。 > 使用しているのはプロKとMWの二種類なのですが、たとえば核酸を染めるような抗体の場合プロKだとまずいのでしょうか。 これもケースバイケースでしょうが、一般的にはKi67などの核内抗原には熱処理が適していると言われています。ただプロK処理でうまく染まっているのなら、別に熱処理にこだわらなくてもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.37-3 - 2009/02/16 (月) 23:36:04 - CJ ぷろKは核酸を消化しないでしょうね。理論上は問題ないでしょう。 ただ、HClとかプロKとかを使った方法は結果が一定しない傾向があります。 私はオートクレーブを使用しています。ふつうのMWとか、粗雑に煮たりするよりかは安定した結果が得られます。温度とか、バッファーのpHとか、処理時間とかを振っていくことになります。 たとえばBrdUの場合、0.01M Sodium Citrate (pH6),１２０℃、２０分でよい結果が得られます。（じつはBrdUの場合、１００度とか異なるpHでもうまく行った経験がありますが。）

(無題) 削除/引用 No.37-2 - 2009/02/16 (月) 21:17:22 - 通りすがり もしプロトコール確立段階でお時間があるようならば色々試してみてはいかがでしょうか。 ナカライテスクのHistoVT Oneのような調製済み試薬もありますのでご検討下さい。

免疫染色の賦活化 削除/引用 No.37-1 - 2009/02/16 (月) 20:47:34 - かた ヒト脳組織の、パラフィン切片を用いた免疫染色で、賦活化を行うときの選別法がわかりません。 使用しているのはプロKとMWの二種類なのですが、たとえば核酸を染めるような抗体の場合プロKだとまずいのでしょうか。

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