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(無題) 削除/引用 No.3713-5 - 2010/12/22 (水) 09:36:11 - z ＞ミカエリスメンテンを使用するので、できるだけ高濃度における代謝実験を行いたいのですが、 これは、「関与する酵素の当該薬物に対するKmよりも十分に濃い濃度」と言う意味であって、とにかく何でも濃い濃度と言う意味ではないことは、了解されていますか？

(無題) 削除/引用 No.3713-4 - 2010/12/21 (火) 15:43:23 - すぐる お二方、早急なご返事ありがとうございました！！ ~さん なるほど！！薬物の不溶性部分をマスクすれば溶けやすくなりそうですが、 ご指摘の通り得られる代謝速度に影響がありそうです。 やはり、肝ホモジネート中の有機溶媒の割合を上げて対応するしか方法はないみたいですね。 あさん すみません書いてなかったのですが、肝ホモジネートを調製する際に使用しているTris緩衝液中にstock solutionを加えた場合も同様に析出がみられました。肝ホモジネートの濃度を薄くしても析出するのではないかと予測しています。

(無題) 削除/引用 No.3713-3 - 2010/12/20 (月) 12:00:38 - ~ 最終的に水に溶けない濃度である以上、stock solutionの溶媒を変えても意味が無いと思いますが。 そもそも水に溶けない濃度である以上、飽和以上の濃度で実験しようとすれば、本来やりたかった実験とは変わってくるのは仕方ないと思いますけど。 �@他の物質で不溶性部分をマスクして水に溶けるようにする �A酵素反応液に有機溶剤を混ぜて溶ける濃度を上げる などで、試薬の溶解度自体を変える必要があるのではないでしょうか。 �@で溶かすだけでいいのであれば、界面活性剤やBSA、デキストランなどに吸着させすれば、析出しにくく出来る場合があります。 ただ、物質そのものに酵素がアクセスしにくくなれば代謝速度も変わるでしょうから、目的のパラメーターを求めることが出来なくなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3713-2 - 2010/12/20 (月) 11:47:51 - あ 薬物が析出しない上限の濃度のまま、肝ホモジネートの濃度を下げるのはどうでしょうか？

stock solutionの作製について 削除/引用 No.3713-1 - 2010/12/20 (月) 11:21:59 - すぐる 薬物代謝実験を行っている実験初心者です。 Tris緩衝液で調製した肝ホモジネートに薬物を添加し、各薬物濃度における代謝速度を求め、ミカエリスメンテン式によりKm, Vmaxを算出しようと計画しています。 使用する薬物は脂溶性であるため、アセトニトリルに溶解させたもの(stock solution)を作製し、それを肝ホモジネートに一定量添加して各薬物濃度のサンプルを作製するという形を取っています。 しかし、薬物を高濃度に溶解させたstock solutionを肝ホモジネートに溶解させた時に白い結晶が析出しました。HPLCで検量線を引いてみたところ、析出がみられた濃度以降でプラトーが確認できたので、薬物が析出したのだと思われます。 析出させない為には、stock solution中の薬物濃度を低くして、肝ホモジネートに添加する量を増やせば良いのですが、混合液中の有機溶媒(アセトニトリル)の割合が大きくなってしまうため、CYPの活性が減少してしまい、代謝速度に影響が出てしまいます。 ミカエリスメンテンを使用するので、できるだけ高濃度における代謝実験を行いたいのですが、析出が起こってしまう、それかといってstock solutionの量は増やすといった対応ができない状況です。 ちなみにstock solutionに用いる有機溶媒を変えて、メタノール、DMSOで試してみたのですが、高濃度時に析出が起こりました。 肝ホモジネートと混合後に析出を起こさず、できるだけ高い濃度のstock solutionを作製したいのですが、何か適当な方法はありますでしょうか？ アドバイスお願い致します！！ 長文失礼しました。

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