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(無題) 削除/引用 No.3717-10 - 2010/12/22 (水) 02:11:00 - むう TK-1さん やはり仰るように何かおかしいですね。 offspringのFACSを行う前に、breeding pairの性別が本当に R26R-EYFP male　x　EIIa-Cre female になっているかどうか、再度確認してみます。結果が出たらまたこちらにupします。 （記録上は性別は問題ないのですが、マウス担当のテクニシャンが記入ミスをしている可能性もありますので）。

(無題) 削除/引用 No.3717-9 - 2010/12/22 (水) 01:56:12 - TK-1 EIIa-creは主に、ESから作ったchimeraからgermline transmissionと同時にselection cassetteを抜くのに使っています。数年以上このシステムを使っていますが、メスのCre mouseからのCre(+)F1ではほぼすべての細胞でdeletionがおこります。モザイクになることは非常にまれです。オスを使っても半分以上の確率で全身でDELETIONが起こり、そうでないときにはmosaicになります。 locusのaccessibilityの問題のような気もしますが、これまで10以上の違うローカスでやってきていますがそこまで悪いのは見たことないです。

(無題) 削除/引用 No.3717-8 - 2010/12/22 (水) 00:43:09 - むう TK-1さん > 私が使っているのはJAX 003724です。 私のマウスも同じマウスです。先ほどJackson Labのテクニシャンの方からメールの返事を頂きました。「EIIa-Cre;R26 reporterのoffspringではBone Marrowでreporter陽性細胞が10%しか出ないことはよくある。しかし3-6％の陽性率はやはり低い。とにかく全てのlitterを解析して、全部同様の低い陽性率だったら再度連絡を下さい」とのことでした。 なかなか子供が増えないので困っているのですが、まずは全て採血して末梢血のFACSで確認したいと思います。 > D. KioussisのVav-creのペーパーでマクロの組織でのYFPを見ていましたが、autofluorescenceが問題なるような印象ではなかったです。 論文を拝見しました。ビカビカとYFPが光っていますね。 私のマウスはマクロ組織でここまで光っていませんでした。低発現モザイクのEIIa-Cre;R26R-YFPを使っているためだと思います。さらにPFA固定した途端に自家蛍光が強くなり、ほぼYFPを確認できなくなりました。 ただ、EIIa-Cre;R26R-CAG-tdTomato (007914) (Madisen et al. Nat Neurosci 2010 vol. 13 (1) pp. 133-40)は、tdTomatoの明るさがもの凄く、全ての臓器が室内光でピンクになっていました。tdTomatoの陽性細胞率は6％しかないのですが。 このたびはいろいろと勉強させて頂きありがとうございました。大変助かりました。 また何かあればお聞きするかもしれませんが、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3717-7 - 2010/12/21 (火) 22:51:57 - TK-1 > 私の購入したEIIa-Creマウスに問題がないかどうか、とりあえずJackson Labにメールにて問い合わせてみました。返事を待っているところです。 私が使っているのはJAX 003724です。 > 「YFPのreporterは十分に明るい」とのことですが、自家蛍光は問題にならなかったのでしょうか？ 私はFACSしかしませんので顕微鏡のことはわかりませんが、このマウスを使っているreferenceはたくさんあると思いますので自分で調べてください。D. KioussisのVav-creのペーパーでマクロの組織でのYFPを見ていましたが、autofluorescenceが問題なるような印象ではなかったです。 > ところでこのプライマーデザインはご自分でされたのでしょうか？ commonはoriginalのSorianoのものです。プライマーのデザインくらいは自分でできるので、後の二つは他の目的で自分でデザインしたものを使っていますが、それが何か？

さらに質問させてください 削除/引用 No.3717-6 - 2010/12/21 (火) 10:22:03 - むう ずっと悩んでいましたので、ご返事をいただき本当に助かります。 > ただ、これまでいろんなローカスでEIIA-CREを使ってきましたが、メスを使ってそこまで飛ばなかったことはありませんので、ほかに何か問題があるような気もします。 私の購入したEIIa-Creマウスに問題がないかどうか、とりあえずJackson Labにメールにて問い合わせてみました。返事を待っているところです。 >このYFPのreporterは十分に明るいです。 EIIa-Creの発現に問題があることが原因かはわかりませんが、私のサンプルでは蛍光顕微鏡下でEIIa-Cre(Cre/WT);R26R-EYFP(F/WT)マウスにおけるYFP発現は、ほとんど自家蛍光にマスクされてしまい確認できませんでした（心臓、肝臓、脾臓、骨格筋）。Invitrogenのrabbit anti-GFP antibody-AF488でも確認できず、さらにこれをgoat anti-rabbit-AF594でenhanceしてようやくdetectできました。 「YFPのreporterは十分に明るい」とのことですが、自家蛍光は問題にならなかったのでしょうか？ ちなみに私の標本処理方法ですが、「冷PBSを心尖部より還流・脱血→標本摘出→4%PFA/PBS 4h at 4C→15% sucrose/PBS 2h at 4C→30% sucrose/PBS overnight at 4C→isopentane in 液体窒素でOCT包埋」です。 ちなみにこの方法でYFPは見えませんが、EIIa-Cre;R26R-tdTomatoの発現は十分に明るく保持されています。 > プライマーは > Common: AAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAG > Pgk-neo reverse: TGTGGAATGTGTGCGAGGCCAGAG > GFP-reverse: ATGCCGTTCTTCTGCTTGTC 大変重要な情報を教えていただき、ありがとうございます。 ところでこのプライマーデザインはご自分でされたのでしょうか？ 以上です。お忙しい中大変恐縮ですが、何卒よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3717-5 - 2010/12/21 (火) 01:51:51 - TK-1 ROSA26は一応すべての細胞で発現する（レベルは違いますが）ので高発現とかrecombinationがおこりやすいと思われていますが、個人的にはそれほど飛びやすいとは思っていません。とくにCreERなんかでやると飛びは悪いです。発現レベルもほかのrandom integrationのTgと比べ、ノックインでコピーナンバーが限られているとはいえ、そんなに高くはないと思います。ただこのYFPのreporterは十分に明るいです。 ただ、これまでいろんなローカスでEIIA-CREを使ってきましたが、メスを使ってそこまで飛ばなかったことはありませんので、ほかに何か問題があるような気もします。 プライマーは Common: AAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAG Pgk-neo reverse: TGTGGAATGTGTGCGAGGCCAGAG GFP-reverse: ATGCCGTTCTTCTGCTTGTC 普通のTaqでannealingは60度くらいでやっていたと思います。バンドサイズはネオが350-400 bp, YFPの方が700bp位だったような気がしますが、その辺は自分で確認してください。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3717-4 - 2010/12/21 (火) 00:58:40 - むう 早速お返事いただきありがとうございます。 オスと違い、EIIa-CREのメスならCreの活性がより早く持続的だと2000 vol. 28 (21) pp. E92に書いてあったので、10週齢のメスとR26R-EYFPを掛け合わせたのですが、YFPの発現している細胞は非常に少なかったです。 骨髄のFACSでたった6％がYFP陽性で、蛍光顕微鏡で見てみた他の臓器（心臓、肝臓、脾臓、骨格筋）も似たようなものでした。同時に購入していたR26R-tdTomatoも似たような比率で、EIIa-CRE側に問題があるような気がします。ちなみに1匹ずつしか解析していませんので、他のlitter mateは違うかもしれませんが。 ＞以前に似たようなことをやっていましたが、このmutant primerはsplice acceptorのものなのでこれで区別はできません。common primerに対してpgk-neoとGFP(YFP)にたいするREVERSEをつくって、PCRでスクリーンしていました。 この方法でスクリーニングをしたいと思います。もし可能であればプライマーデザイン、もしくは元ネタの論文を教えて頂けませんでしょうか？Rosaマウスを辿ってSoriano（Nat Genet1999）とSrinivas（BMC Dev Biol2001）の論文を見ましたが、PCRに関しては詳細不明でした。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3717-3 - 2010/12/21 (火) 00:40:43 - TK-1 No.3717-2 - 2010/12/21 (火) 00:19:41 - TK-1 以前に似たようなことをやっていましたが、このmutant primerはsplice acceptorのものなのでこれで区別はできません。common primerに対してpgk-neoとGFP(YFP)にたいするREVERSEをつくって、PCRでスクリーンしていました。 EIIa-CREのメスを使えば、受精前のoocyteでcreがaccumulateしているのでほとんどの場合はほぼすべての細胞でdeletion はおこりますが、雄を使ったり、古いメスを使うとそれなりにモザイクなります。厳密に言うとTISSUEごとに差が出るのかもしれませんが（逆にTAIL で判断したものが見たい組織で反映されるとは必ずしも限らない訳で）、末梢血を採ってFACSで見てしまうのも手っ取り早いです。

EIIa-Cre;Rosa26 reporterマウスのgenotyping 削除/引用 No.3717-1 - 2010/12/20 (月) 22:57:35 - むう はじめまして。 Rosa26 reporterマウスのgenotyping PCRについて質問します。 現在、EIIa-Cre(B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J)マウス（Cre/Cre）とR26R-EYFPマウス（B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J）マウス(F/F)を掛け合わせて、全身にYFPを発現するマウスを作製しようとしています。 この際、卵子内のEIIa-Creの活性化される微妙な時間のずれにより、F1では下記2種類のマウスが生まれるはずです（Jackson Labリンク参照）。 http://cre.jax.org/B6_EIIa/B6_EIIA-cre.html つまり、 1)全身でYFPが発現するマウス (Cre/WT;d/WT) 2)モザイク状態でYFPが発現するマウス、です(Cre/WT;d/WT細胞とCre/WT;F/WT細胞の混在)。 (d; delete, F;floxed) 1)だけが欲しいので、上記2種類のマウスをPCRで確認できないかと考えています。 下記Jackson Labのgenotyping　PCRプロトコールで可能でしょうか？ http://jaxmice.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:543894739474385::NO:2:P2_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:926,006148 つまり、1) WT allele, 2) floxed allele (>Neo>EYFP), 3) deleted allele (>EYFP)の3種類のalleleを oIMR4982-AAG ACC GCG AAG AGT TTG TC-Mutant oIMR8545-AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT-Common oIMR8546-GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG-Wild type のプライマーセットで見分けることができるできるのか？ということです。 このページではPCRバンドは2本しか出てこないようですので、ちょっと見分けられないような気がします。Southern Blotをすれば分かるようですが、経験がないものでPCRで何とかならないものかと思い、質問させて頂きました。

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