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なるほど・・・。 削除/引用 No.3734-13 - 2011/01/02 (日) 13:28:08 - だい 差出人のだいです。返信が遅れてしまい、すみません。いろいろなご意見をどうもありがとうございます。DNase1のbufferにはCa++は入っていなかったと思いますし、RTもrandom primerとoligo dTの合剤（Takara Primescript RT master mix）を使っているので、oligo dTのみでやってみたほうが確かにプラスミドからのcDNAもどきができなくなりますね。まだ改善の余地がありそうです。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3734-12 - 2010/12/28 (火) 10:08:54 - Boston-Pullman 制限酵素による部分切断だと、確かにプライマーが奪われてしまいそうですね。 ちなみにRTはランダムヘキサマーなのでしょうか？そうだと、コンタミしたプラスミドからもcDNAモドキができてしまいます。 オリゴdTで改善されると良いのですが。

(無題) 削除/引用 No.3734-11 - 2010/12/27 (月) 21:24:10 - おお >[Re:9] とおりすがりさんは書きました : > 予めDpnI処理してプラスミドをバラバラにってのは > だめかしら．．． 細胞内で複製されるタイプの発現系だったら、消化効率が下がりますね。 制限酵素も結局はDNAを消化する酵素で、切れるか所がDNase 1より少なくなるぶんだけ不利なような気がしますが、どうなんでしょうね。確かに強い酵素もありますし。。。 exonuclease とかDNase処理の時に入れると端から削ってくれるので消化効率がよくなりそうですが、こういうのに使える酵素とか知りません。。。

(無題) 削除/引用 No.3734-10 - 2010/12/27 (月) 20:50:42 - AP 制限酵素の類で鋳型となる配列の中を切断するだけだと、それ由来のPCR産物はできないにしても、primerを食ってしまうdecoyになってしまいそうで、定量的なPCRの場合、干渉するんじゃないかと思うのですが、どうかしらん。

(無題) 削除/引用 No.3734-9 - 2010/12/27 (月) 17:03:58 - とおりすがり 予めDpnI処理してプラスミドをバラバラにってのは だめかしら．．．

(無題) 削除/引用 No.3734-8 - 2010/12/27 (月) 16:07:39 - Boston-Pullman DNaseの効きが悪いのであれば、制限酵素でプラスミド上のcDNA部分を分断することは出来ませんか？制限酵素とデザインしたプライマーの位置の条件が合えば、理論上プラスミドのコンタミによる影響はなくなります。

(無題) 削除/引用 No.3734-7 - 2010/12/27 (月) 09:57:01 - ~ 素人考えですが、導入遺伝子のプロモーター領域などの非転写領域をコントロールにできませんかね。 普通の一過性実験であればexogenousなプロモーターでしょうし、導入遺伝子と同じコピー数ありますよね。 プロモーター領域はPCRで増えにくいこともあるので、こちらが増えなくなったからといって、目的の配列も分解されたとはいえないかもしれませんが、DNaseのかかり具合の目安になりそうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.3734-6 - 2010/12/26 (日) 18:53:46 - AP 過去トピにもありますが、 通常、DNase Iの反応バッファーにはMg++が加えられていますが、さらにCa++があると格段に効きが良くなります。RT-PCRの前処理を想定した製品によっては、添付バッファーにCa++が入っているものもありますね。

(無題) 削除/引用 No.3734-5 - 2010/12/26 (日) 18:41:14 - おお RNA iso plusはトライぞーるとほぼ同様の試薬だと思います。 http://www.ambion.com/techlib/tips/dnase1demystified.html ambionがこの件に関して解説をつけています。 もし差し支えなければ発現ベクターでイントロンをもつもの(プロメガpCIなど)をつかえば区別はできる可能性がありますね。 polyA精製だともしかしたらもっとましになるかもしれません。ライセートから直接polyAをとるキットも出回っていたと思います。コスト面ではどうなるかよくわかりませんけど、カラムよりやすいものが見つかればそれでもいいかと。

どうもありがとうございます 削除/引用 No.3734-4 - 2010/12/26 (日) 16:41:51 - だい 迅速な返信をどうもありがとうございます。カラムが高価なのでケチってTAKARAのRNA iso plusで回収し、DNase処理後、PCI処理をしていました。 改めてDNase処理前のRNAサンプル、DNase→PCI処理後のRNAサンプル（RNA濃度が大体500 ng/μlくらい）をそれぞれ30倍希釈し、そのままリアルタイムPCRしてみました。ゲノムDNA中の遺伝子量と比べ、一過性発現させた遺伝子量は500倍くらい多く、DNase処理することによって両方ともDNA量は格段に落ちますが、それでも一過性発現させた方の遺伝子はDNase処理前で15サイクル、DNase処理後でも22サイクル目くらいから立ち上がってくるので、これではmessage量は定量できないことを改めて実感いたしました。ゲノムDNAについてはDNase処理によって30サイクル以降の立ち上がりであったので実質的には無視できると考えられ、ゲノムDNAのコンタミを防ぐと言う意味ではDNase処理は成功していると言えると思います。 改めてよく振り返ってみると、以前サンプルで頂いたカラムを使ったときにはきちんと期待されたリアルタイムの結果が出たことから、カラムの方がDNase処理よりもきちんとプラスミドを除けるんだとわかりました。 ただ、カラムはどうしても高価なので出来れば購入は避けたいのですが、DNase処理時間を長くしたり、おおさんのおっしゃるようなtrizolを使うなどの方法で、よりプラスミドを効率よく除ける方法をご存知の方がいらっしゃったら、教えてくださると助かります。どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3734-3 - 2010/12/26 (日) 16:06:44 - おお もし可能ならトランスフェクション後回収する日を若干ずらして、コピー数が減ったところでという方法も考えられますが、発現による効果との兼ね合いもありますので、ご自身の系で可能かどうかお考えになるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3734-2 - 2010/12/26 (日) 16:02:30 - おお GEのきっとでon columnでDNase消化して精製し、RIをつかったPCR(エチブロより可也感度が高くリニアリティーのある所で検出でき、定量性がある)で検出していますが、導入したプラスミドの発現mRNA検出の際、プラスミド自身は検出されないほどのレベルまで抑えられます。 トライゾールなどの試薬だと何処までできるか分かりませんが、精製後DNase処理をしてもう一度トライゾールで再精製するとましになるかもしれません。トライゾールはDNAを意図的にのぞけるように作られてますから。 確かに除きにくいというのはあると思います。

細胞に一過性導入したプラスミドのDNase処理 削除/引用 No.3734-1 - 2010/12/26 (日) 13:31:16 - だい 今、細胞に一過性導入した遺伝子の発現をrealtime RT-PCRで見ています。ただ、コンストラクトがcDNA由来なので、RNA中のプラスミドの混入を除去する必要があり、DNase処理をしていますが、どうも結果がしっくり来ず、プラスミドが混入している印象を受けます。このフォーラムの過去のトピックを見ていたところ、通常のゲノムDNAでなく、細胞に一過性導入したプラスミドDNAは除きにくいのではないかと思われるご意見をいくつか拝見しました。実際にそういうご経験のある方はいらっしゃいますか？もしそうならば、どのように処理すればよいか、ご教授いただけると幸いです。どうぞよろしくお願いいたします。

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