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ノックイン？の作成方法 トピック削除
No.374-TOPIC - 2009/04/22 (水) 17:55:02 - GFP
初歩的な質問で申し訳ありませんが、遺伝子組み換えの方法についてお聞きしたいことがあり書き込みました。

現在、ＧＦＰをゲノムのある遺伝子に下流に組み込みたいのですが、漠然としたイメージしかなく、どのように進んでいいのかつかめていません。
知りたい点は主に以下の点です。

・ＧＦＰは組み替えによって目的部位に挿入されると思うのですが、その際どのようなベクターを使えばよいのか。
・ベクターにはＧＦＰ以外にどの配列を入れればよいのか（構築方法）。
・作成したベクターはどの細胞にも入るのか。出来れば、セルラインを使いたいです。

以上の基本的な点について書いてある教科書・論文等ご存知であれば教えてください。お願いします。
　
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No.374-9 - 2009/04/24 (金) 09:02:09 - GFP
皆様
情報ありがとうございます。
お教えいただいた情報を一度読んで理解したいと思います。

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No.374-8 - 2009/04/23 (木) 13:29:40 - att
InvitrogenのMultisite Gateway Systemを利用して
Knock-in vectorを作成するプロトコルです。
参考にしてください。

http://www.cdb.riken.jp/hsct/pdf/protocol_3.pdf

(無題) 削除/引用
No.374-7 - 2009/04/23 (木) 08:42:02 - DSC
WEBを検索したら原理を説明するこんなページを見つけたので、まずはこちらからでいかがですか？
http://www.nig.ac.jp/museum/genetic/05_r.html
参考図書も載っています。
ベクターは基本的には、組み込みたいリポーター遺伝子断片、標的部位のgenomic DNA約10kb、NeoRなどのポジティブ選択用マーカー遺伝子、tkやDTなどのネガティブ選択用マーカー遺伝子を組み合わせて自作します（バックボーン部分はpUC系のふつうのプラスミドでよい）。理研の神戸だったか、標的部位のDNAだけを組み込めば完成するようなプラスミドの分与をされているラボがあったような。
まずは、ESをターゲティングする方法でよいのかという点を十分検討された方がよいと思います。ES細胞自体特殊で少々手間のかかる部分もあるし、結構高価な培地添加物が必要だったりしますから。

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No.374-5 - 2009/04/23 (木) 08:04:37 - GFP
ご返答ありがとうございます。
ＥＳのターゲッティングでは普通に出来るということなので、その方法が詳細（使用プラスミド等々）に書かれている論文・教科書を教えていただけないでしょうか？イメージだけではなく、実際にテクニックを身に付けたいので。

(無題) 削除/引用
No.374-4 - 2009/04/22 (水) 23:44:31 - DSC
内在性の遺伝子にコードされるタンパク質にGFPをフュージョンさせて発現させることにより、その遺伝子の発現量を視覚的にモニターしたいということですよね？　ESだったらふつうに行われているターゲティングの手法で作れると思います。その遺伝子をノックアウトした影響を心配する必要がなくて、プロモーター・エンハンサーなどの活性だけ見ればよいのであれば、ふつうのターゲティングでATG以降をまるごとGFPのORFと置換してもよいかもしれません（もとの遺伝子のATG以降に強い調節配列が存在するかもしれませんが）。そこまでして調べても、本来の発現量を忠実に再現できるかどうかは微妙だと思いますが。ESでもいいのかな？って気もします。ていうか、そこまでしたらマウス作っちゃえって気になりませんか？　発現の発生段階・組織特異性まで調べることができちゃいます。

(無題) 削除/引用
No.374-3 - 2009/04/22 (水) 18:42:24 - GFP
目的としては、単純に遺伝子の発現をＧＦＰでモニタリングできればと考えています。また、別の系ではエンハンサー等のシスエレメントも入れてみたいと思っています。
その際、目的の遺伝子全長をＰＣＲで取ってきてＧＦＰを付けてプラスミドに組み込み、安定発現株をとるという方法ではなく、あくまでendogenousの遺伝子にＧＦＰをつけたり、シスエレメントを挿入したいと考えています。

ただ、研究の目的よりも、どのようにして目的部分に目的遺伝子を挿入するかというテクニカルな部分を細かく知りたいと思っています。ですので、一般的な方法が細かく書かれている論文や教科書を参考に勉強したいです。また、セルラインでは難しいのであれば、ＥＳ細胞等でもいいです。

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No.374-2 - 2009/04/22 (水) 18:25:01 - 中年
哺乳類培養細胞での話ですよね。汎用されている細胞では相同組換えの頻度は高くないので、ノックインはたいへんですよ。目的は何ですか。

ノックイン？の作成方法 削除/引用
No.374-1 - 2009/04/22 (水) 17:55:02 - GFP
初歩的な質問で申し訳ありませんが、遺伝子組み換えの方法についてお聞きしたいことがあり書き込みました。

現在、ＧＦＰをゲノムのある遺伝子に下流に組み込みたいのですが、漠然としたイメージしかなく、どのように進んでいいのかつかめていません。
知りたい点は主に以下の点です。

・ＧＦＰは組み替えによって目的部位に挿入されると思うのですが、その際どのようなベクターを使えばよいのか。
・ベクターにはＧＦＰ以外にどの配列を入れればよいのか（構築方法）。
・作成したベクターはどの細胞にも入るのか。出来れば、セルラインを使いたいです。

以上の基本的な点について書いてある教科書・論文等ご存知であれば教えてください。お願いします。
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