ばいや様
コメントありがとうございます。
>想像するに見ているバンドは非特異ではないかと。
>検出抗体がなにか分からないし、PC、NCも分からないからなんともいえないけど。
>シグナルが機能しているとは限りませんし。
高濃度イミダゾールで溶出したものをCBBに供してもbandすら見えない状況です。
検出抗体は抗His抗体もしくは、抗V5抗体を使用しています。
シグナルを付加しなかったネガコンでは細胞外へ分泌されないことは確認しております。
またNCとして、Sf9に何も感染させなかったものでは、抗His抗体ではなにもbandは検出されません。
以上のことから、シグナルはきちんと機能しており、ものは確かに細胞外へ分泌されていると考えております。
>次に精製効率は100%ではないでしょう。こちらを何とかしたほうが・・・。もちろん発現量を多くしたほうがいいのですが。回収率を調べてみたら。
はい。当然精製効率は100 %ではありません。回収率は100 %と見積もっております。
>Sf9よりHighFiveの方がいいとは言われていますが、上手い人が行えばの話です。
やはりそういう感覚なのですね。
細胞を変えれば劇的に上手く行くというものではないんですね。。
>モノによっては72時間がいいとは限りません。24時間で十分ならそれでもいいし、1週間くらいでもよければそのほうがいいです。何も考えないのなら72時間がベターと思います。
time courseをとってdpi0, 1, 2, 3, 4, 5で培養上清中の目的のタンパクの産生を見るとdpi3までモノは増加していって、dpi4で抗His抗体で染まるbandは減弱していきました。そのためdpi3で私は行っております。
ウイルスtiterか、Sf9の細胞の状態が悪いのでしょうか。
ばいや様も分泌タンパクを作らせておられますか？
その際の細胞数や産生スケール、virus titer等をもしお時間がありましたらご教示いただけませんでしょうか？またちょっとした産生のコツや産生効率をあげるためのテクニック等ありましたら併せてご教示いただけますと幸いです。
どうぞ宜しくお願いします。 |
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