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(無題) 削除/引用 No.3761-11 - 2011/01/03 (月) 03:29:16 - Ted おおさま、Boston-Pullmanさま、Tさま 皆様、貴重な名案を頂きましてありがとうございました。 IRES後の配列の重要性についても勉強になりました。 早速、試して行きたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3761-10 - 2011/01/02 (日) 15:15:34 - Ｔ まあ一番早くて簡単なのは直接 PCR でしょうね。 IRES の頭の配列、IRES-目的遺伝子をまたぐ配列、目的遺伝子 3' 端の配列の３つのプライマーを作り、2段階 PCR で [EcoRI]-[IRES]-ccatgtcg-[目的遺伝子]-[SalI] というフラグメントを増幅して、プラスミドの EcoRI-SalI サイトに入れれば出来上がりです。

(無題) 削除/引用 No.3761-9 - 2011/01/02 (日) 14:55:18 - Boston-Pullman 「このNcoIサイトに続いて別にコザック配列とatgtcg...をつないでも問題なく発現されるのでしょうか」 どうしても完全を目指したいのであれば、atggcgの変異遺伝子をNcoIサイトに組み込んで、site-directed mutagenesisでatgtcgに戻すのが確実だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3761-8 - 2011/01/02 (日) 13:44:48 - おお Boston-Pullmanさんの話によればNcoIのATGがファーストコドンになるという原則がありそうなので1stにしたいMetの位置をずらさない方がいいという指摘に沿った方がいいと思います。 コンパティブルな制限酵素をつかうかBsmBIみたいな制限酵素の認識部位と切断部位がちがうものでCATGを露出させてやるかで解決するかもしれません。BsmBIとかこのあたりの酵素はマイナーな酵素なので、どれがいいとか少しサジェスチョンしにくいですが、カタログなどの特性などよく確認して使えそうかどうか確認してください。多分わたしはBsmBIを使ったことがあったと思いますが、ちょっと正確に思い出せません。 http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0580.asp

(無題) 削除/引用 No.3761-7 - 2011/01/02 (日) 11:58:48 - Ｔ IRES の場合、ATG の位置がかなりクリティカルに効いてくると聞いてますので、私なら位置を変えることはしません。 タグ等の余分な配列を付けるのも一案ですが、ネイティブな蛋白を発現したいなら、NcoI とコンパチブルな断端で atgt... となる酵素、PciI や BspLU11I を使って組み換えるという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.3761-6 - 2011/01/02 (日) 11:07:59 - Ted おおさま、Boston-Pullmanさま ご教示ありがとうございます。 タグなしでそのまま挿入するのがまずは安全かと思いますが、 うまくatggで始まらない遺伝子を挿入する場合、 「このNcoIサイトに続いて別にコザック配列とatgtcg...をつないでも問題なく発現されるのでしょうか」 というのは、Boston-Pullmanさまのコメントから問題がありそうですね。 タグなしで挿入する他の方法がございましたら、ご教示お願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3761-5 - 2011/01/02 (日) 10:25:11 - Boston-Pullman 汎用されているIRESはECMV由来で、同定されている開始コドンは今議論になっているNcoIのATG１つだけです（ポリオのIRESには複数の開始コドンがあったと思います）。リボソームがリードスルーする可能性は否定できませんが、宿主機能を利用するウイルスの性質上、優れた１stATGなのだと思います。 翻訳複合体の構成成分は5'CapとIRESとで異なるので、ひょっとしたらATGの認識機構が異なるのかも知れません。でも、おそらく構成成分が異なるのはIRESへ5'Cap-independentにリボソームをrecruitするための工夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3761-4 - 2011/01/02 (日) 08:15:02 - おお タグを入れるということで解決しそうなのですね。 N末タグが入ることにあまり抵抗がないなら、N末タグに使われている実際の配列をATGから挿入するとその配列は1stコドンとして働いているという意味で発現は期待できるだろうという推測ができます。 折角そのGFPの1stが機能していると分かっているならそこをのこして2ndのATGとか10アミノ酸くらい下流から挿入するという手もあります。まあそれであったらGFPそのままN末タグのほうがスッキリするとはおもいます。短いアミノ酸でタグとして認識する抗体がなければ、発言が確実かもしれませんが、FLAGなどつけるより有用性が半減します。 もしタグを嫌うなら、挿入したい遺伝子の 1stコドンであれば、そのまま入れてもおそらく1stコドンとして働いてくれるだろうと言う考え方もできます。これも推測ですがタグを嫌うなら私はそのまま挿入すると思います。 ひとつ私がよく分からないところはIRESごのATG(1stコドン)は通常の1stコドンと同様の特徴を持つかどうかです。これはIRESをよく使う人の意見があった方がいいかもしれません。 タグをつけるのはいいのですが、分泌タンパクやN末が重要な役割を持つ時はお気をつけください。

(無題) 削除/引用 No.3761-3 - 2011/01/02 (日) 07:19:57 - Ted Boston-Pullmanさま 素晴らしいideaに感銘をお受けしました。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.3761-2 - 2011/01/02 (日) 06:15:12 - Boston-Pullman 私なら、いざというときのために、FLAGタグを頭につけます。 つまり、IRESのNcoIをFLAGの1stMetにします。目的の遺伝子はMetを除いたものをFLAG下流につなげてfusion proteinを作らせます。 IPもできるし、目的遺伝子の２番目のコドンを変えているわけでもないので、一石二鳥だと思います。

NcoIに続く翻訳開始配列について 削除/引用 No.3761-1 - 2011/01/02 (日) 04:51:26 - Ted いつも勉強させて頂いています。 pMIG(MSCV_IRES_GFP)の中のGFPを他の遺伝子のcDNAに置換しようと考えています。 このGFPはNcoIとSalIで切り出せます。 IRESとGFPの間にNcoIサイト（ccatgg）があり、GFPの1st atgはこのサイト中のものが使用されています。 挿入目的遺伝子がatggで始まるものであれば問題ないのですが、atgtcg...で始まるものを入れようとする場合、皆様でしたらどのようにされますでしょうか。 2番目のアミノ酸を変えたくないので、このNcoIサイトに続いて別にコザック配列とatgtcg...をつないでも問題なく発現されるのでしょうか。 この場合、NcoIサイトのatgから翻訳が開始されてしまうということはあるのでしょうか？ ご教授のほど宜しくお願い致します。

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