全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ふやすものてかも 削除/引用 No.3766-9 - 2011/01/05 (水) 14:24:30 - ema ＞ここではPrimer, Template量などを変えるのではなく、PCRのelongationやannealingの時間や温度を変えることで、PCRの反応効率を上げ、感度を上げれる方法 前提条件に有るとはいえ ChIPして微量からというので、酵素反応の改変だけでだめなら、OvationSystemで（1細胞からというキット有ります）量をふやしてから（どうしても増幅バイアスはかかりますが）とか、（サイクル数たんにあげると怖いので）Nested PCRの構築も考慮に入れては。

(無題) 削除/引用 No.3766-8 - 2011/01/04 (火) 12:09:44 - ンンノ サイバーの経験はあまりありませんが、PCR酵素を比較検討するのは十分価値が あると思います。 メーカーによって増えやすい方向にチューニングしていたり、特異的な増幅の 方向にチューニングしていたりするようです。 あとは条件見当ですが、何でも増えやすい条件にするとかえって低コピー数の ところで再現が悪くなるような気がします。伸長反応時間は出来る限り短くし てみたりするといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3766-7 - 2011/01/04 (火) 05:45:58 - 310 私は微量希釈の際にToyoboのEasyDilutionを使っています。またDNAの吸着がしにくいチューブはeppendorfなどのメーカから、同等の目的のチップはUSA Scientificなどから購入可能です。吸着の問題は低濃度のDNAでは馬鹿にならないと思います。微量希釈、微量サンプル専用で使っていますので、たぶんコストもさほど差がつかないと思います。 ラボメイドのSYBR-MixでABI7500FASTでINVITROGENのER-SYBRのtwo-step並みの増幅効率を出すためには、three-stepにしなければなりませんでしたし、denatureも少し長くしています。具体的には1stdenature-95C20sec 95C3sec&60C30sec40cycleのところ、1stdenature- 95C20sec 95C6sec&60C20sec&68C25sec40cycleでやっています。せっかくのFASTのスピードが台無しにはなりますが、”効率”は上がります。もちろん鋳型とプライマーによって、各時間調整は異なりますので、最適化は必要と思われます。

(無題) 削除/引用 No.3766-6 - 2011/01/04 (火) 04:10:36 - Boston-Pullman ChIP assay なのですね。 １ 目的たんぱく質が効率よく標的配列に結合する細胞、刺激を見つける。 ２ 細胞数を増やす ３ PCR productのサイズを大きくしてシグナルを強くする。ただ、プライマーを変えたくないとのことなので無理ですね。 すぐ思いつくのはこの程度です。

(無題) 削除/引用 No.3766-5 - 2011/01/04 (火) 00:46:21 - が ンンノさま コメント有り難うございます。 「100コピーに近づけたい」です

(無題) 削除/引用 No.3766-4 - 2011/01/04 (火) 00:41:51 - ンンノ サイバーの系では反応系中に１００コピー程度が現実的な検出限界で、TaqMan にすれば１０コピー程度が検出限界というのがコンセンサスになってると思います。 「１００コピー」に近づけたいのか、「１００コピー」をなんとか改善したい のかどちらでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3766-3 - 2011/01/04 (火) 00:24:25 - が Boston-Pullmanさん コメントありがとうございます。 実は反応効率が悪いわけではありません。サンプル中のターゲット量が低い為に検出感度をあげたいのです。 現在、QPCRをする際に、検量線を引く為の１０倍希釈系列のStandardを使っています（たとえば濃度が高い順に、10ˆ5, 10ˆ4, 10ˆ3, 10ˆ2, 10ˆ1, 10ˆ0)。濃度の高い４つのStandard (10ˆ5~10ˆ2)では綺麗な検量線を引くことができるのですが、希釈倍率が大きくなるごとに(10ˆ1, 10ˆ0)PCRのレプリケイト間でのバラツキが大きくなり、信頼性の低いデータになりますよね（いわゆるExtrapolatedな状態）。つまりQPCRの検出限界以下だとデータの再現性および信頼性が低下します。サンプル中のターゲット量はその検出限界のボーダーあたりにあるのです。ちなみに、検出感度以下のサンプルだと全く同じサンプルを測定してもバラツキがでます。検出感度以上だとそのバラツキは全くありません。 なので、レプリケイト間でのバラツキがサンプルによって大きくなる場合があり、検出感度をあげることでそのバラツキをなくしたいと思っています。 ちなみに検量線から逆算した増幅効率は1.87程度です。 すこし分かりにくい文章になったかもしれませんが、宜しくお願いします。 抗体は実績があり信頼できるものなので、今後抗体を変えてChIp assayする予定はありません。

(無題) 削除/引用 No.3766-2 - 2011/01/03 (月) 23:51:50 - Boston-Pullman 今の系の反応効率が悪いとの前提で質問されていますが、どの程度悪いのでしょうか？

Q-PCRの感度を上げる方法 削除/引用 No.3766-1 - 2011/01/03 (月) 21:01:46 - が 現在SyberGreenの系でreal time PCRを行なっています。 PCRの条件を変えることによってQ-PCRの感度を上げるコツを教えて頂けないでしょうか？ ここではPrimer, Template量などを変えるのではなく、PCRのelongationやannealingの時間や温度を変えることで、PCRの反応効率を上げ、感度を上げれる方法をお願いします。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---