全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3768-12 - 2011/01/06 (木) 16:04:43 - ひむ AP様、再度素早いレスをありがとうございます。 愚問をすみません。お恥ずかしい限りです。孔径が小さいとのると思っていました。

(無題) 削除/引用 No.3768-11 - 2011/01/06 (木) 15:30:59 - AP あのね、NCはPVDFよりはるかに結合力が弱いのですよ。その製品は使ったことありませんが、いくらポアが小さかろうと、低分子に強いとうたわれていようと（実際、能書きではどの程度の分子量を保証しているのでしょう？）、私ならNCという時点でオリゴペプチドのブロットには選択しません。

(無題) 削除/引用 No.3768-10 - 2011/01/06 (木) 15:09:51 - ひむ AP様、素早いレスをありがとうございます。 食い下がるような尋ね方で恐縮なのですが、WhatmanのBA79（0.1 um）などは低分子に強い膜として使ったのですがこれでは不十分だったのでしょうか？ 材質が違う物を使えばうまくいくかも知れません、やってみなくては分かりませんという具合に受け止めよと言うことですね。

(無題) 削除/引用 No.3768-9 - 2011/01/06 (木) 14:24:45 - AP 出来ないことはないけれど、十分に大きい分子量を持つタンパク質と同じ感覚でやっても出来ない、ということです。先に言ったように最大の要因は、オリゴペプチドは、普通使われる担体にはほとんど結合しないということにあります。 ですから、すくなくとも先にあげたような低分子に強いといわれているPVDFのように、それなりの性能をもつメンブレンを選ぶということは必須だと思います。 同等のもので、PallのFluoroTransというのもありました。また、同社には共有結合で固着させるタイプのUltraBindあるいはImmunodyneというメンブレンもあるようです。 http://www.pall.com/laboratory_963.asp#LL

(無題) 削除/引用 No.3768-8 - 2011/01/06 (木) 13:52:19 - ひむ AP様ありがとうございます。 つまり、20アミノ酸前後のオリゴペプチドのドットブロットは出来なくてもしょうがないと言うことでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3768-7 - 2011/01/05 (水) 21:06:13 - AP タンパク質は主に疎水結合力でメンブレンにくっつくだけなので、分子量の小さなoligo-peptideがメンブレンによく固着しないのは当たり前のことだと思います。そういう目的でペプチドと共有結合を生じるように修飾したPVDF (Immobilon-AV, Millipore)もあったようですが、現在はカタログから消えているようです。 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W9V-45PTS47-80&_user=10&_coverDate=06%2F30%2F1993&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=browse&_origin=browse&_zone=rslt_list_item&_srch=doc-info%28%23toc%236692%231993%23997889997%23312041%23FLT%23display%23Volume%29&_cdi=6692&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=29&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ee0d8a1ced40d0d6c86f4b1a3259c971&searchtype=a 比較的低分子量のペプチドを保持できるというPVDFもあるようですが(Immobilon-P-SQ, Millipore、Sequii-Blot, BioRadなど)、oligo-peptideでどれだけ効果的かはわかりません。 ブロットした後に、乾燥させるとより強く結合すると言われています。ニトロセルロースならいったん乾燥させても、再びバッファーに湿らせて検出反応ができます。PVDFなら乾燥させてから、バッファーを浸潤させずに表面だけに触れさせて検出を行う「迅速法」がMilliporeで提唱されていますから、応用できるのではないでしょうか。 >であれば、スポット後にBSAで膜全体をブロッキングすることでOKなのではないでしょうか？ そういうことではないです。定量的な希釈、ブロットをするときのキャリアの重要性については過去トピで論議されていたと思います。

(無題) 削除/引用 No.3768-6 - 2011/01/05 (水) 18:51:14 - ひむ w様、レスありがとうございます。 つまりその点がうまくいかない原因だと解釈してよろしいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3768-5 - 2011/01/05 (水) 09:32:22 - w >スポットあたりのタンパク質量を一定にするため、 であれば、スポット後にBSAで膜全体をブロッキングすることでOKなのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3768-4 - 2011/01/05 (水) 08:32:11 - ひむ レスありがとうございます。 > BSA水溶液ではなく、タダの水（可能ならPBS）でペプチドを希釈して直後にスポットします。 スポットあたりのタンパク質量を一定にするため、そして希釈・ピペッティング時のチューブやチップへの吸着を防ぐためにBSA溶液を用いていました。BSA溶液を用いると膜が飽和してしまってペプチドが吸着できないと言うことでしょうか？ニトロセルロース膜で約100 ug/cm2なので大丈夫と言えば大丈夫だけれどきわどいと言えばきわどいですね。この点がクリティカルだったのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3768-3 - 2011/01/04 (火) 22:42:20 - w >ニトロセルロース膜には1 mg/ml BSA水溶液にペプチドを希釈してそのまま2 ulずつスポットし、 BSA水溶液ではなく、タダの水（可能ならPBS）でペプチドを希釈して直後にスポットします。 >PVDF膜にははじめに1-2 ulのメタノールをのせてすぐにその上から上記希釈液2 ulをのせ、風乾させるという方法で固定しています。 PVDF膜なら、膜全体をMeOHウェッティングしたあとPBSに置換して、乾かないうちに（もしくはラップで被うなど工夫して）、ペプチドサンプル（PBS溶液）をスポットします。 膜への吸着に取り立てて、吸着のための時間を設定する必要はありません。 一見して添加したペプチドの水滴が完全に浸み込んでいるようであれば、BSAかスキムミルクのブロッキング液に漬け込んでしまいます。PVDF膜の場合に、膜そのものが乾燥しているなら、MeOHウェットとPBSリンスの後で、ブロッキングに入ります。

ペプチドのドットブロットについて 削除/引用 No.3768-1 - 2011/01/04 (火) 17:37:05 - ひむ 類似のトピが他にもありましたが、ペプチドのドットブロットに関して今問題に直面していますのでどうぞよろしくお願いします。 あるペプチド（21アミノ酸）のドットブロットが出来なくて困っています。 ペプチドの組成は、 hydrophobic: 9 neutral : 5 hydrophilic: 7 です。 1 spotあたり100-0.0064 ngと量を振ってスポットしています。 これが少なすぎるとは思えません。 はじめはその辺に転がっていた0.2 umのニトロセルロース膜を使ったところ何もでず、次ぎに0.45 umのPVDFを用いても何もでませんでした。 ペプチドが膜に保持されていない可能性もあるのでWhatmanのBA79（0.1 um）のニトロセルロース膜を試したけれどFLAGは全くダメ、当該ペプチドは一番濃いところに非常にうすく見えたのみです。 ニトロセルロース膜には1 mg/ml BSA水溶液にペプチドを希釈してそのまま2 ulずつスポットし、PVDF膜にははじめに1-2 ulのメタノールをのせてすぐにその上から上記希釈液2 ulをのせ、風乾させるという方法で固定しています。 Sigmaで購入したFLAGペプチドをM2でブロットするというポジティブコントロールをおいていますが、これすら全く見えません。 抗体は同じ抗原を認識するもの4種類を用いており、且つ抗体の方に問題が無いと分かっています（少なくとも抗FLAG抗体は絶対動いているものです）。 風乾のステップですが、目で見て乾燥したらすぐに（約10分位）次のステップに行ってしまっていますが、ここがいけないでしょうか？風乾は何時間もした方が良いでしょうか？ これはもうペプチドの特性で膜に保持されにくいと言うことでしょうか？ FLAGペプチドはドットブロットに向かないのでしょうか？ 長くなりましたが、どうぞよろしくお願いします。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---