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mutationの導入について トピック削除
No.3769-TOPIC - 2011/01/04 (火) 18:03:22 - HT
自作したpromoter constructの塩基配列にミスマッチがあったため、修正を加えるという作業をしておりますが、なかなかうまくいかずご相談させていただきました。
自作プロモーター　CTTTCCCCCCTCCCCC-CCTCCACCTCTTTC
正しい配列　　　　CTTTCCCCCCCCCCCCACC-CCACCTCTTTC
用いているprimerは以下の通りです。
CTTTCTCCACCCCACCCCCCCCCCCCTTTC 5'-3'F 30bp
GAAAGGGGGGGGGGGGTGGGGTGGAGAAAG 5'-3' R 30bp

上記のような配列の修正をpfuとdpnIを用いて行っています。
プロトコールは
Reaction:　temp time
1 95℃ 30 sec
18サイクル
95℃ 30 sec
58℃ 1 min　　　
68℃ 2 min/kb of plasmid length　12分（コンストラクト2kb；ベクターが４ｋｂ程度です）
4度　

Dpn I 処理
そのまま反応液にDpn Iを0.4mlいれ、37℃ 1hr。
ここでいったんsolutionを4μ程度流してチェックしています。
PCR後の電気泳動後にバンドは確認できるのですが、dpn処理後の産物を流してみると消えてしまいます。

このプロトコールで、今までうまくやれていたのですが今回はコロニーが全く生えてきません。
問題点として、以下のことなどを考えています。
１）deletion2カ所とmismuch1カ所同時は困難
２）トータル６ｋｂ程度はdpnIを用いたこの方法では困難
３）プライマーに問題あり

解決法などについてご指導、アドバイスいただけましたら幸いと存じます。よろしく御願い致します。
　
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勝手な感想ですが 削除/引用
No.3769-5 - 2011/01/06 (木) 12:50:21 - こうじ
6kbp程度なら普通に行くはずです。
３箇所変えるにしては変異塩基が端に近い気がします。
プライマーの端からもう少し離したほうがよいのでは？
5'と3'の配列が似すぎているのも気になります。

新年ですし気分も新たにしたチャレンジで
うまくいきますように祈っております

反応液は25マイクロリットルで、
Dpn Iは0.4マイクロリットル入れているということでよいのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3769-4 - 2011/01/05 (水) 00:05:28 - ab
プロモーターの配列は5'->3"ですか？
それで、記載のプライマーではPCRがかからないような…

(無題) 削除/引用
No.3769-3 - 2011/01/04 (火) 19:37:56 - 中年
PCR（正確にはPCRではないのですが）後の電気泳動で観察されるバンドは、反応産物なのでしょうか。反応が進んでいなくて、最初に加えた鋳型のDNAが見えているだけということはありませんか。

(無題) 削除/引用
No.3769-2 - 2011/01/04 (火) 18:39:26 - ~
生える生えないの前に、DpnI処理時にPCR産物が分解しているのが問題ですよね。
考えられている１、２、３はDpnI処理時のPCR産物の分解には繋がらないと思います。

おそらくは使用されているDNA polymeraseはhigh fidelityの3' → 5' exonuclease活性を持つ酵素ですよね。何かの条件のせいで、この活性でPCR産物が丸ごと分解されていたりしませんかね。
このDNA polymeraseかDpnI（にコンタミしているDNase?）がPCR産物の分解の原因の有力候補かと思います。

前者であれば、いったんカラム精製やゲルからの切り出し等でDNA polymeraseを除けば、DpnI処理してもPCR産物が分解されなくなるはずです。
手っ取り早くDNA分解の原因を切り分けるために、一度PCR産物を精製されてみてはいかがでしょうか。


また、やられているのは
http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/b10.html
の原理のやり方ですよね。
このやり方の場合、DpnIをかけないわけにはいかないでしょうから、
DpnIでPCR産物も分解されたらお手上げですよね。

http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/idenshi/archives/2006/11/kod_plus_mutagenesis_kit.html
のように、Inverse PCRを使えば、最悪PCR産物さえ得られれば、DpnIを使わなくても、ゲルから切り出してligationして進められますよね。
どちらかのプライマーを（短めにでも）作り直せばもう一方のプライマーは流用できるでしょうから、トラブルが長引きそうであればこちらも試してみてはいかがでしょうか。

mutationの導入について 削除/引用
No.3769-1 - 2011/01/04 (火) 18:03:22 - HT
自作したpromoter constructの塩基配列にミスマッチがあったため、修正を加えるという作業をしておりますが、なかなかうまくいかずご相談させていただきました。
自作プロモーター　CTTTCCCCCCTCCCCC-CCTCCACCTCTTTC
正しい配列　　　　CTTTCCCCCCCCCCCCACC-CCACCTCTTTC
用いているprimerは以下の通りです。
CTTTCTCCACCCCACCCCCCCCCCCCTTTC 5'-3'F 30bp
GAAAGGGGGGGGGGGGTGGGGTGGAGAAAG 5'-3' R 30bp

上記のような配列の修正をpfuとdpnIを用いて行っています。
プロトコールは
Reaction:　temp time
1 95℃ 30 sec
18サイクル
95℃ 30 sec
58℃ 1 min　　　
68℃ 2 min/kb of plasmid length　12分（コンストラクト2kb；ベクターが４ｋｂ程度です）
4度　

Dpn I 処理
そのまま反応液にDpn Iを0.4mlいれ、37℃ 1hr。
ここでいったんsolutionを4μ程度流してチェックしています。
PCR後の電気泳動後にバンドは確認できるのですが、dpn処理後の産物を流してみると消えてしまいます。

このプロトコールで、今までうまくやれていたのですが今回はコロニーが全く生えてきません。
問題点として、以下のことなどを考えています。
１）deletion2カ所とmismuch1カ所同時は困難
２）トータル６ｋｂ程度はdpnIを用いたこの方法では困難
３）プライマーに問題あり

解決法などについてご指導、アドバイスいただけましたら幸いと存じます。よろしく御願い致します。
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