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(無題) 削除/引用 No.3773-17 - 2011/01/06 (木) 13:15:00 - ンンノ 気分を害されるかもしれませんが、説明がかなりヘタですね。 通常のPCRだとワークするプライマーがサイバーの定量PCRだとワークしない ということですね。 プライマーの配列を変えてください。 博打でもなんでもないです。 反応液系中のサイバーの存在がPCRに影響するのは特別なことではありません。 普通は複数のプライマーセットを検討して、結果の良いセットでデータをとります。

(無題) 削除/引用 No.3773-14 - 2011/01/06 (木) 00:08:36 - LMT TSさん； 　仰る通りです。少し暴走しすぎたと反省しております。このtroubleshooting でかなり時間を費やして、時間ばかりが過ぎていく中、かなりいらついておりました。いろんな人に聞いて回っているうちに、説明ばかりになっており、何のいいアドバイスも得られない中で、このフォーラムにたどりつき、また説明ばかりになって、frustration が溜まってしまいました。気を悪くした方にお詫び申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3773-13 - 2011/01/06 (木) 00:02:00 - TS >いつも長々とアッセイの詳細を説明させられるだけで、何のまとも得ない回答が多い中、 みんな好意で書き込んでくれていると思うんですけど。 質問しておいて、これはちょっと。。。

(無題) 削除/引用 No.3773-12 - 2011/01/05 (水) 23:43:45 - LMT tmlさん； えーっと、それじゃあ試薬メーカーの戦略に乗せられてバンバン予算を使っちゃってくださいｗｗ 確かに、僕も含めて昨今の研究者はいわゆる、kit scientist ではあります。だからこそ、有効なものは使用しつつも、しっかりとそのバックグラウンドも把握して使用すべきです。現代のサイエンスの世界では、のんびりやっているとすぐに誰かに研究されてしまいます。使うところは使う！という研究スタイルは現代のサイエンスでは、必要不可欠だと思います。取り残されるとどんどん研究費も得られないようになります。それに、誰も思いつかない様な大研究をなさっている！または、できるような研究者はほんの一握りだと僕は思います。 こういう意見を仰るのでしょうから、僕の質問に対するお答えも、tmlさんは、何のキットも使用せずとも解決できる方法を思いつかれているのでしょう。ご教授お願いしたいです。

(無題) 削除/引用 No.3773-11 - 2011/01/05 (水) 23:14:01 - tml えーっと、それじゃあ試薬メーカーの戦略に乗せられてバンバン予算を使っちゃってくださいｗｗ

(無題) 削除/引用 No.3773-10 - 2011/01/05 (水) 22:38:22 - ami > いつも長々とアッセイの詳細を説明させられるだけで、何のまとも得ない回答が多い中、 えぇぇぇぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.3773-8 - 2011/01/05 (水) 22:32:16 - LMT Boston-Pullmanさん； 　的確かつ、簡略なコメントありがとうございました。こういう答えを待っておりました！実は、僕も、サイバーグリーンにおけるプライマーのsequence dependent 的な阻害反応が起こっているのでは？と疑問視しておりました。ぜひ、eva green の詳細を見て、検討してみたいと思います。プライマーのデザインのし直しも一般的なアドバイスですが、それでは、あまりにも博打的で、有効的な解決法ではないので、このeva greenのことを知れて感謝いたします。 　いつも長々とアッセイの詳細を説明させられるだけで、何のまとも得ない回答が多い中、こういうバシッとしたアドバイスを頂けると一歩前進できるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.3773-7 - 2011/01/05 (水) 13:02:52 - mom-a >サンプルによっては、増幅しております（かなり強いバンドが検出されます。qRT-PCR後に電気泳動で確認しました。しかし、CT値は、undetectableとなります。 「うまくいきませんでした」という一言から、上記のような状態を想像できる方はほとんどいらっしゃらないと思います。 PCRが上手くかからない⇒増幅しない、というのと、増幅しているのにソフト上でCt値が検出できない、というのは別の問題ではないでしょうか。 増幅曲線は描けていますか？増幅曲線の形は確認されましたか？ 増幅しているのにundetectableということだと、シグナルが検出されていない（他の遺伝子では検出できるということだと、シングルピークであっても、実は全体がスメアになっていてシグナルが埋もれているとか？）、増幅曲線の形が歪んでいる、とか…。 >濃度勾配といえば、プライマー、テンプレートの最終濃度を減らしたり、増やしたりして反応系の変化を見たのですが、 失礼しました。これは私の読み間違いでした。「プライマー、テンプレート、マグネシウムの」濃度勾配ということですね。 real timePCRの反応条件を検討する場合、私でしたらテンプレートの濃度は調整しますが、プライマー、マグネシウムの濃度は変えません。アニーリングの温度を調整し、それで増幅効率80〜120%に入らないならプライマーを設計し直します。

(無題) 削除/引用 No.3773-6 - 2011/01/05 (水) 12:00:43 - Boston-Pullman プライマーの配列によっては、サイバーグリーンでPCR反応が阻害されます。だからといって、色素の量を下げると、効率が上がってもシグナルが弱くなります。 Eva Green は評判がいいです。試してみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3773-5 - 2011/01/05 (水) 11:50:16 - LMT ご意見ありがとうございます。 「うまくいかない」とは、PCRがかからない⇒増幅しない、電気泳動した時にバンドが出ない、ということでしょうか？ 　サンプルによっては、増幅しております（かなり強いバンドが検出されます。qRT-PCR後に電気泳動で確認しました。しかし、CT値は、undetectableとなります。機械自体には何の問題もありません。その遺伝子のみ反応系がおかしくなるので。。 　通常のPCRでは酵素、反応試薬等が異なる、（あるいは使ったサンプルが（精製度等も）異なる？）のでこの条件でもPCRがかかるということも十分あり得るのではないでしょうか。 　その可能性もあると思いますが、ハウスキーピングの遺伝子は、同サンプル中でも問題なく、CT値が検出されます。確かに、プライマーの効率はよくありませんが、それでも増幅されるものもCT値が確認できないのが、不思議でなりません。くどいですが、同サンプル中のほかの遺伝子では何の問題もありません。そういう憶測は、できます。ただ、もう少し、PCRの反応を向上できる具体的な解決策を提示してもらえるとうれしいのですが。。。 　マグネシウムの濃度勾配はともかく、プライマー、テンプレートの何をどう試したのですか？ 　濃度勾配といえば、プライマー、テンプレートの最終濃度を減らしたり、増やしたりして反応系の変化を見たのですが、それ以外に何かあるんでしょうか？明らかにPCR産物のテンプレート、プライマーの最終濃度を変えることで、反応系が促進、後退するのと同じ反応を期待したのですが、何の変化も見られませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3773-4 - 2011/01/05 (水) 11:20:56 - mom-a 「うまくいかない」とは、PCRがかからない⇒増幅しない、電気泳動した時にバンドが出ない、ということでしょうか？ 縦軸にCt値、横軸にLog[希釈倍率]をとって検量線を描いた時に傾きが-4ということでしょうか？ だとすると、増幅効率は80％未満ということにならないでしょうか？qRT-PCRを行うには、効率が悪いように思います。 PCRの条件が悪いので、検量線サンプルではPCRがかかるが、サンプルでは精製度が劣る等の問題からPCRがかからない、という可能性があるのではないでしょうか。 >同じプライマーを使用して、ある組織からのcDNAを使った通常のPCRでは、ポジティブの組織から得られたcDNAと同じように、ちゃんとシングルのバンドが強く検出できます。 通常のPCRでは酵素、反応試薬等が異なる、（あるいは使ったサンプルが（精製度等も）異なる？）のでこの条件でもPCRがかかるということも十分あり得るのではないでしょうか。 >プライマー、テンプレート、マグネシウムの濃度勾配も試しましたが、うまくいきませんでした。 マグネシウムの濃度勾配はともかく、プライマー、テンプレートの何をどう試したのですか？

(無題) 削除/引用 No.3773-3 - 2011/01/05 (水) 05:34:55 - LMT 　目的遺伝子をPCRで増幅した後で、そのPCR産物を精製して、ログスケール（x12）で希釈したものをテンプレートとして使用し、プライマーの反応効率を見ています。slopeが-4 とプライマー的には、効率のよいプライマーとは言えませんが、増幅可能なことは確かです。

(無題) 削除/引用 No.3773-2 - 2011/01/05 (水) 05:19:58 - ンンノ >スタンダートカーブとして使うPCR産物は、増幅可能という理解不能な結果が出ます。 この文章が理解不能です。 プライマーなしでも増えてしまうということですか？ PCR産物は精製しましたか？

qRT-PCR について 削除/引用 No.3773-1 - 2011/01/05 (水) 04:28:05 - LMT ある特定の遺伝子をサイバーグリーンを用いたqRT-PCRで定量したのですが、うまくいきませんでした。その遺伝子は、同じプライマーを使用して、ある組織からのcDNAを使った通常のPCRでは、ポジティブの組織から得られたcDNAと同じように、ちゃんとシングルのバンドが強く検出できます。つまり、かなり多く発現しております！！ それに、ネガティブの組織のcDNAには、何も検出されず、NoRTコントロールもきれいなネガティブコントロールとなっています。また、バンドのサイズもポジティブと比べて全く同じで、BLASTサーチでも、目的遺伝子のみ増幅する結果が出ています。 しかし、同じサンプルをサイバーグリーンを用いたqRT-PCRでやるとうまくいきません。意外にも、スタンダートカーブとして使うPCR産物は、増幅可能という理解不能な結果が出ます。 　 　プライマー、テンプレート、マグネシウムの濃度勾配も試しましたが、うまくいきませんでした。しかも、ハウスキーピングの遺伝子は、同じサンプル中で綺麗に定量できます。こうなると、違いは、プライマーのみとなりますが、どうしてこうなるのか、もうお手上げ気味です。なにか提案のある方がいらしゃればお願いします

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