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(無題) 削除/引用 No.3776-11 - 2011/01/06 (木) 22:00:20 - Actias 僕はトピ主さんのいう配列が比較的長いので、ベクター込みで目的遺伝子を別のベクターに入れようとしていて、ダブルoriで目的物が取れないのかと疑ってます。

(無題) 削除/引用 No.3776-10 - 2011/01/06 (木) 17:18:49 - おお amiさんに一票入れておきます。これで原因に探りを入れれるはずですよね。

(無題) 削除/引用 No.3776-9 - 2011/01/06 (木) 17:16:23 - おお もしPCRの鋳型の持ち込みであれば薬剤耐性マーカーが一緒ならDpn I消化をするといいとおもいます。PCRフラグメントにない酵素処理などで複数箇所きってしまってもある程度効果があるかもしれません。とくにゲル切り出しとのコンビネーションなら。 電気えいどうのえいどうそうのコンタミを疑う余地はありませんか?使用直前に一度よく洗った方がいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3776-8 - 2011/01/06 (木) 09:28:10 - mAb templateのplasmidをAsw�T、Afl�Uで消化した場合、現状の切れ方をしませんか？ なお、PCRのtemplate（pDNA）は1ng程度で充分です。それ以上持ち込むと、PCR産物ではなくtemplate由来のcolonyが多数形成されます。

(無題) 削除/引用 No.3776-7 - 2011/01/06 (木) 08:25:54 - nana PCRの鋳型になったプラスミドがAmp耐性遺伝子を持つのであれば 鋳型のプラスミドがそのまま増えてくる危険性があります。 このような場合、PCR産物のクローニングには、 Kan耐性など別の抗生物質でスクリーニングできるベクターを用いるべきです。

っていうか 削除/引用 No.3776-6 - 2011/01/05 (水) 22:37:01 - ami シーケンス読んで、pGEMでないベクターだってわかったなら、何のベクターかわかるじゃん。。

(無題) 削除/引用 No.3776-5 - 2011/01/05 (水) 22:07:07 - Actias （さっぱりわからん） その3.4 kb のインサートって、どんなもの？ 「全部がマウス由来遺伝子」 「5'からヒト、ベクター由来の配列、ウイルスプロモーター」 など、具体的な説明が欲しい。

(無題) 削除/引用 No.3776-4 - 2011/01/05 (水) 18:53:08 - ~ 何をしたいのかが伝わらないので、どうすれば貴方のゴールに近づくのかが分かりません。 同じ配列が同一ベクター内に存在することになるので、組換えでデリーションなどを起こす可能性はあるとは思います。 ただ、デリーションしたpGEMベクターが取れたのではなく、関係ないベクター（テンプレート？）しか取れていないのであれば、デリーションが起きてとれないとまではまだ言えないでしょう。 使用したDNAのグラム数や得られたコピー数の話が無いので、取れる見込みがある話なのかどうかなどはさっぱり分かりませんが、 デリーションが問題になるような状態にまで話が進めば、stblシリーズなどで組換えを抑制して取れるかもしれません。 また、コンピタントセルを変えなくても、カナマイシン耐性ベクターなどにアダプターをつけて使えば、取れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3776-3 - 2011/01/05 (水) 16:47:16 - おお 私もテンプレートを疑いたくなりますね。

(無題) 削除/引用 No.3776-2 - 2011/01/05 (水) 16:05:55 - ああああ PCRのテンプレートのプラスミドではないですか？

ｐＧＥＭ−easyへのライゲーションで　変なことが 削除/引用 No.3776-1 - 2011/01/05 (水) 15:59:29 - あゆ 　よろしくお願いします。 プラスミドをリコンビナントＰＣＲしてつくった　３．４ｋｂ（プライマー５’Asw�T、３’−Afl�U） くらいのインサートをつくり目的の大きさのバンドが得られたので　ゲルから切り出しＡを付加して　キットの　pGEM−easyにライゲーションをしました。 白コロニーをひろい　ミニプレップをして　制限酵素できったところ ところが制限酵素である　Asw�T、Afl�Uできり確認をしたら　３．４ｋｂの インサートはとれたものの、切れてはいけない　ベクターが　二箇所で 切れてしまいました（２ｋｄと１ｋｂくらいの大きさ）。 　そこで　シークエンスをよんでみたところ、pGEMでないベクターに インサートが入っていることがわかりました。 （そしてその３．４ｋｄのバンドは　私が欲しい配列でした） 　 　このインサートには　あるプラスミド由来の　アンピシリン耐性の遺伝子が 入っているのですが、　これがｐＧＥＭ−easyに入ることを邪魔するということはありますか？ 　教えてください。

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