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(無題) 削除/引用 No.379-11 - 2009/04/23 (木) 18:28:34 - 名無し 尿素含有サンプルでは尿素の分解などが気になります。すぐ使い切るならいいとおもいますが、長期保存だと、pHが上がったり変な修飾がおきたりする心配があるような。また加熱できないので、還元が完全にいくかどうかも少し気になります。 あと還元というとジスルフィド結合がまず考えますが、ほかにサイオエステル結合も切断すると思います。グリシン残基とシステイン残基の間でできます。よく知られている例としてユビキチンやその関連蛋白質の修飾の際に、修飾酵素との間で一時的に作られるのがあります。可能性としては大きくないですが、一応考慮しておくのもよいかも。

(無題) 削除/引用 No.379-10 - 2009/04/23 (木) 15:04:40 - おお 尿素はSDSと同様タンパクの構造を壊しますが、酸化還元反応は お考えになっているような状況では起こらないと思います。 SDSと同様でSーSで結合しているタンパクのSーS結合は切らないので SーSで結合しているコンプレックスは１分子として流れると思います。 ただしタンパク自身の構造は壊れているのでSーS結合のない コンプレックスはほとんどの場合外れてしまうと思います。 これもSDSと一緒だとおもいます。 SーS結合についてほんとにしっかりやりたいなら、溶液の酸化 還元電位をコントロール、モニタリングしたほうがいいかもしれませんが この辺はわたしは調べないと答えられません。 ただし前述のようにもしかしたら全体の数%とか、サンプル調整の どこかでSーSが壊れている可能性は否定するのは難しいと思います。 尿素であってもSDSで煮沸するにしてもタイムコースをとると、 その処理によりどの程度SーS結合に影響するか分かるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.379-9 - 2009/04/23 (木) 14:35:51 - Acha No.379-8さん ご指摘ありがとうございます。私の目的のタンパク質は細胞膜に存在しております。ただその分子にはシグナル配列が存在し、一方、膜貫通領域が存在しておらず、当初は分泌型であることを考えておりましたが、膜に存在するということが分かりました。何かの膜タンパク質と結合することによって膜に局在している可能性が高いと考えております。また目的分子内で共有結合していないと考えられるCysが存在していることから、disulfide結合で他の分子と局在している可能性を考えております。もちろん、言われるように目的分子の一部がモノマーとして存在していることも予想しております。その可能性を調べるために、煮沸より弱い条件を知りたかったということです。 おおさん ありがとうございます。教えて下さい。尿素による変性で、複合体は離れませんか？ subaruさん ありがとうございます。参考になります。

(無題) 削除/引用 No.379-8 - 2009/04/23 (木) 14:02:16 - 名無し もともとその蛋白質の全分子がS-Sを作っている訳でなくて一部は生体内でもモノマーとして存在してい単にそれが見えてるという事ではないでしょうか。また本来はモノマーで、外に抽出したことで酸化されてS-Sができて、一部S-Sをつくらなかったものが見えたという可能性もあります。抽出した細胞内蛋白質の場合、検出されたS-Sがアーティフィシャルなものか、生理的な条件でももともと出来ているものかの区別は難しいと思います。細胞外蛋白質や血漿蛋白質は別として細胞内蛋白質でS-S結合をつくっているものは少ないような気がします。

(無題) 削除/引用 No.379-7 - 2009/04/23 (木) 12:19:46 - おお ラフな書き方をしましたが、たいたい皆さんが言っている時間で 妥当ではないかと思います。私はかなりラフにやってます。 60ー70度なら温まればとりあえずいいという感じです。 きっと試行錯誤てきにきれいにいく条件をみつけれる感じになるでしょう けど、基準はその時きれいに流れたかどうかということだとと思いますので 厳密な基準がないというのもほんとですし。 また、煮沸しないで尿素(ファイナルで4ー6M)入りのサンプルバッファーを使えば混ぜると即使えそうな きがします。尿素はカオトロピックなエージェントですしタンパクの構造をはかいします。 ただし、厳密に電気えいどうやサンプルを扱っている時にどの程度SーSが外れているか またはサンプリングのときの状況を反映しているか知るのは結構難しいものがありね。

(無題) 削除/引用 No.379-6 - 2009/04/23 (木) 09:56:45 - subaru うちでは、膜タンパクを65度15分の加熱処理でやってます。 95度5分の条件で凝集してゲルに入らなかったものでも上記条件ではうまく流れました。 ジスルフィドが外れるかどうかは分かりません。

(無題) 削除/引用 No.379-5 - 2009/04/23 (木) 09:52:48 - Acha No.379-3 さん ありがとうございます。まさしく、私が知りたかった内容です。 4oC O/N、37oC 30~60 minですね。確かに、その位が適当なのかなと考えていたところです。非常に助かりました。 また仰るようにnative PAGEやBN-PAGE（この方法は知りませんでした。勉強になります）の方が、私の実験には適しているのかもしれません。考慮に入れさせて頂きます。 再度となりますが、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.379-4 - 2009/04/23 (木) 09:43:35 - Acha おおさん。ご回答ありがとうございます。 私も温度を低くした際には、その分、時間を長くすべきということは存じております。 では実際にどの温度ではどの程度の時間、サンプルを加温させると、充分なSDSによる変性が起こるのかを知りたいのです。 ご存じの方がおられましたらお教え下さい。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.379-3 - 2009/04/23 (木) 09:42:32 - ~ 4oC O/Nや、 37oC 30~60 min でやっている人はいますね。 ただ、それぞれ対象のタンパク質では十分SDS化できる条件としてやっているでしょう。 Achaさんのタンパク質でその条件が十分なのか不十分なのかはtime courseを取ってみないと何ともいえないでしょう。 絶妙なインキュベーション時間を検討するよりも、 いっそのことSDS化せずに、native PAGEやBN-PAGEでやってしまった方がはっきりとした結果が出るような気もします。

(無題) 削除/引用 No.379-2 - 2009/04/23 (木) 05:32:06 - おお ただその温度でインキュベートするのが基本ですが、、、 温度が低いとSDSによる変性に時間がかかると一般に言われています。

非還元状態の煮沸について 削除/引用 No.379-1 - 2009/04/23 (木) 05:23:13 - Acha 質問させて下さい。 サンプルバッファー（非還元状態で）を煮沸してウエスタンブロットを行ったところ、目的のサイズ(75kDa)と、高分子（250kDaと160kDa)にバンドが検出されました。（もちろん、還元下では75kDaのみが検出されます。） 目的のサイズのバンドが非常に濃いので、煮沸による影響で、複合体が外れたのでは無いかと危惧しております。そこで、SDSがタンパク質と結合できうる弱い条件でサンプルを調整したいと考えているのですが、どなたか、37℃、あるいは６０℃、室温等で試す条件をご存じでしたらお教え下さい。煮沸すると、還元剤無しでもある程度のdisulfide結合がはずれてしまう場合があると聞いたことがあります。 何卒宜しくお願い致します。

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