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(無題) 削除/引用 No.3791-9 - 2011/01/21 (金) 05:48:21 - 310 ami様、橘様　お教えいただきありがとうございます。 ami様 >50ngくらいでやってる。POP6で700くらいは読めてる。。 キャピラリーは長いタイプ(61cm)だと思います。集中的に700bpを読むことがあれば、購入し使おうと思います。 橘様 >ただ、POP7だとプライマーの近くの波形が乱れるため、その辺りもきっちり >読みたい場合は困りますが 1-2kbまでのインサートであれば、外注ではVector配列のmulti cloning site上にあるT7やM13Rなどの配列を使い、読み残しの部分や、判断しがたい場所をGene specificなprimerとPOP4＆310で解析しようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3791-8 - 2011/01/20 (木) 19:56:04 - 橘 3730との比較だとどうしてもそうなってしまいます。 そもそも310にはどんなに頑張っても平均700bp以上読む能力はないと思います。 ものすごく具合の良いキャピラリに当たったときにものすごく具合の良いサンプルでやっと700bpというところでしょうか。 全く同じ反応産物を分けて3130と310で比べたことがありますが、3130/POP7/Standardキャピラリなら具合が良ければ1,000bp近く読めますが310/POP6/LongReadキャピラリだと700bpが限界でした。 1kbp以上の長さを読みたいのであれば、外注(3730xl)で両側から読む方がおすすめです。 96wellプレート単位で送れば1サンプル当たり500円以下でやってもらえるはずです。 ただ、POP7だとプライマーの近くの波形が乱れるため、その辺りもきっちり読みたい場合は困りますが。

Plasmidなら 削除/引用 No.3791-7 - 2011/01/19 (水) 09:46:08 - ami 50ngくらいでやってる。POP6で700くらいは読めてる。。

(無題) 削除/引用 No.3791-6 - 2011/01/19 (水) 05:28:57 - 310 seq様、　橘様、　教えてくださりありがとうございます。 seq様 ＞私はtemplate DNAは400-500ngがベストだと思います。 私は5kbのplasmidで500ng/5ulでやっております。ピークの高さは500bpまでは、ほぼ均一ですがベースラインが乱れることがあります。seq様に比べ反応液量が少ないため、もう少し減らそうと思っております。 橘様 >Sequencing AnalysisでBasecallするときに、高すぎるピークがあるときは開>始点をその後ろに設定することで高いピークより後ろが長く読めることがあ >ったと思いますが試されてますか。 試しております。解析できたりできなかったりします。raw dataのベースラインが乱れてしまうと、どうも駄目なようです。一つのデータをkb basecallerとPOP4 basecallerと同時解析してみたところ、シーケンスプライマーに近いところははPOP4 basecallerが、遠いところはkb basecallerがきれいに読めていますので、これと橘様のおっしゃった方法を組み合わせて配列を解析しております。 インジェクションを調整するとPOP4のデフォルトの泳動条件で得られる、最後のデータ(550-600bp)まで、kb basecallerの青いバー（信頼性が黄や赤よりも高い)が示されるようになりましたが、一部のサンプルを、ABI3730を用いている施設に委託したところ950bpまで完璧に読んであったため、少しがっかりしました。自分でやるのと委託の価格差は500bp内の解析では大きくなりますが、今回の1.4kbでは310での解析のためにインサート内にシーケンスプライマーを設けていることなどから、時間、コストの両方で委託に負けた思いです。

(無題) 削除/引用 No.3791-5 - 2011/01/17 (月) 22:04:34 - 橘 Sequencing AnalysisでBasecallするときに、高すぎるピークがあるときは開始点をその後ろに設定することで高いピークより後ろが長く読めることがあったと思いますが試されてますか。 私は基本的に自動設定での解析をしてから、その結果を見ながら手動で設定を変更してBasecallをやり直してました。

テンプレート 削除/引用 No.3791-4 - 2011/01/17 (月) 20:55:50 - seq テンプレートDNAの話が出たので、追加。 私はtemplate DNAは400-500ngがベストだと思います。 DNA 400-500ng/10µl 0.8µM primer 4µl BigDye 4µl buffer 2µl total 20µl の反応で問題ありません。 これ以上DNAを増やすと、それこそtop heavyになって200−300bp位で力尽きますよ。

(無題) 削除/引用 No.3791-3 - 2011/01/15 (土) 08:47:09 - 310 ats様 教えていただきありがとうございます。 ＞それよりも、ピークが高すぎる＝シークエンス反応が過剰＞長い産物ができ＞ない＝長い配列の決定できない方が問題だと感じます。 最高ピークが200-300bpにきているので、鋳型過剰なのかもしれません。POP4と37cmキャピラリの組み合わせだと500bp付近までしか読めないので、あまり気にしてませんでした。もっと長く読めるシーケンサーだと、鎖長に比例したピーク高さの減少も顕著に出たのかもしれません。 >レーンが余っているとき(うまく行かないとき）は、鋳型の量を1/3,1,3倍に >して反応させると、時間の無駄が無い（どれかで読める）と聞きましたし、 >実際そうです（反応液総量8uL、さらに自作のBigDye反応薄め液を使っていま>す）。 次回試してみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3791-2 - 2011/01/11 (火) 10:39:25 - ats 検出器の感度はよいので、50ほどでも(他の塩基のピークと）山が分かれれば塩基の決定は可能ですね。30ほどだと山がグタグタのものが多いです。 それよりも、ピークが高すぎる＝シークエンス反応が過剰＞長い産物ができない＝長い配列の決定できない方が問題だと感じます。 レーンが余っているとき(うまく行かないとき）は、鋳型の量を1/3,1,3倍にして反応させると、時間の無駄が無い（どれかで読める）と聞きましたし、実際そうです（反応液総量8uL、さらに自作のBigDye反応薄め液を使っています）。経験的には鋳型は、少ないほうが長く読める時が多いですね。

ABI310-BigDye最適なピークの高さ 削除/引用 No.3791-1 - 2011/01/08 (土) 10:15:40 - 310 経験則で知りましたが、うちのABI310の最適なrawピークの高さはC（青）のベースラインからのピーク高で300-1500程度のようで、2000を超えた場合、300bp以降のベースラインがみだれピークがブロードになって、読み取り精度が大幅に低下します。頂点がつぶれたsaturated peakは5000-6000くらいで、最適泳動量はシグナル検出限界よりも低めのようです。 このような結果のサンプルをインジェクションを短くして再度泳動すると半分以上は読み取りが改善しますが、改善できないサンプルもあります。 アクリルアミドやアガロースでもサンプルが多すぎるとピークがゆがむので、このような現象は起きて当然なのかもしれませんが、シーケンスのピークにはラベルのつかなかったDNAが含まれないので、鋳型の量も関係あるかもしれません。わたしの扱いに問題があるのではとか、キャピラリが古くなったら泳動条件が厳しくなるとか考えて不安になっています。 参考にさせてもらいたいので、皆様のシーケンサでもこのような現象が起きるのかとお使いのDNAシーケンサでのrawピークの最適値を教えていただけないでしょうか？310がベストですが、他のキャピラリシーケンサでも構いません。 よろしくお願いいたします。

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