全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3792-9 - 2011/01/09 (日) 20:49:12 - こうじ 上手く行けば儲けもので トライしてみるのも実験として必要かもしれません。 どの論文か忘れましたし探す気もありませんが、 タンパク質の調製にメンブレンフィルターで分画した論文もありました。 私はその手のフィルターは 目的産物の濃縮に使う程度ぐらいにしか使えないと思っています。 みなさんが挙げられているものにひとつ加えるとすれば イオン交換カラムでしょうか。 上手く行けば濃縮カラムにもできます

(無題) 削除/引用 No.3792-8 - 2011/01/09 (日) 14:21:08 - か ちなみに、モノマーであることは間違いないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3792-7 - 2011/01/09 (日) 13:03:20 - ABZO 分子シャペロン関係なら、Ni-カラムに結合させた後にATPとか含むバッハーで洗ってそれから溶出とかはどうよ。蛋白質の専門じゃないから詳しい事は良く知らないけど、昔同じような事がたまにあったとき、先生にそんな風に習ったんだが。 リコンビナント蛋白質発現させてない細胞のライゼートではくっ付いてこないならたぶんそれらは目標とする蛋白質に比較的強くassociated したproteinsとおもう。たいていはnon-covalentだけどね。s-sとかの可能性もなくはないけど。 大事な事は、O/Eに起因してアーティフィシャルにくっていているだけのものなのか、興味ある蛋白質はもともとそういう複合体として機能するものなのかで、後者だと単に除去すればよいという単純な話ではないかもね。いちばんいいのは、それぞれのバンドをゲルから切り出してMSで同定してみるといいね。大腸菌ライゼートからならNi-カラムでも、けっこういいかんじに精製されているだろうから、昔のMALDI-TOFのペプチドマスフィンガープリントでも同定できるんじゃないかな。とりあえず相手の正体がわかれば、今後の対策や方向性もたてやすいでしょ。

(無題) 削除/引用 No.3792-6 - 2011/01/09 (日) 06:24:55 - おお デタージェントが入っていたらもっと難儀な状況になっているかもしれません。 シャペロニンの可能性もありそうです。ゲル濾過で様子みてはどうでしょうか?両者が結合していれば挙動がオーバーラップしますので、その場合はATPとデコイをつかった解離処理後ゲル濾過やイオン交換、またはNiカラムといったてが取れます。

(無題) 削除/引用 No.3792-5 - 2011/01/09 (日) 03:09:18 - えええ 50 kDa cutoffと言いますが メーカーが保証するのは「50kDa以上の分子を通過させないフィルターメンブレンを使用している」ということろまでで 「50kDa未満の分子は素通りする」と保証してくれるわけではなかったはず。 通過するかしないかは、個々の分子種の性質によるのでやってみないとわかりませんが 30kDaの蛋白質と50 kDa cutoffのアミコンの組み合わせなら、半量以上がフィルターメンブレンを通過せずに失われてもおかしくないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3792-4 - 2011/01/09 (日) 02:02:46 - Boston-Pullman 以前似たトピでコメントしましたが、シャペロンとして100kDaのたんぱく質が目的たんぱく質に結合していたら、その方法では回収できません。 試してみないとなんともいえないのですが、うまくいかなかったら上記の可能性があるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3792-3 - 2011/01/09 (日) 00:38:15 - NEM SDS-PAGEのバンドのサイズで議論するのは危険ですね。限外ろ過の分画は実際の溶液中の見かけの分子量に依存します。溶液中の分子量が30kと100kの分子を50k-cut off の限外ろ過膜で分画できるか、という質問に対しては、分画できる可能性はありますが、目的物をろ過して回収するのは結構難しです。問題は目的の30kの回収率で、一般的に50k-cut off ではあまりよくないと思います。 それよりも、100kの混入が問題なので、非特異的結合の多い Ni-resin ではなくHisタグに対して特異性の高いコバルトを試してみてはどうでしょうか。お試しサンプルを提供してくれるところもあるみたいなので、検討されてはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.3792-2 - 2011/01/08 (土) 21:50:00 - ００ やってみれば？タグ切ってもっかいNiカラムに通すのが常道だとは思うけど。 変性PAGEでの見た目の分子量じゃなくて、ゲルろ過とかで分子量を決定して30Kと100Kなんだよね、一応・・・？ ちなみにアミコンウルトラで似たようなことをやったことがあるけど、自分の場合はうまくいきませんでした。

アミコンでほしい30kのタンパク質を60kのコンタミから分離したい 削除/引用 No.3792-1 - 2011/01/08 (土) 21:26:19 - アミコン 大腸菌にて組替えタンパク質を発現させました。 ヒスタグが付いており、30 kDaです。 Ni-カラムで大腸菌lysateから目的のタンパク質を回収し、イミダゾールで溶出しました。 するとメインバンドは目的の欲しい30 kDaバンドと、100kDaの謎のバンドの２本です。 どうにか100kDaのタンパク質を除きたいのですが、この時例えば50 kDa cutoffのアミコンのチューブを使うのはアリでしょうか？ つまり、50kDa cut offなので100kDaはfilterをpass throughせず、もう一方のメインバンド、つまり欲しいタンパク質だけが下へ行く。これを回収して精製したものとする、これはアリなのでしょうか？みなさんの見解を教えてください！

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---