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GST-fusion proteinの精製法について トピック削除
No.3793-TOPIC - 2011/01/09 (日) 20:13:46 - グルタチヲン
GST-fusion proteinを質量分析にかけるため、大量抽出を行っております。
約100mLのタンパク抽出液からGST-fusion proteinを精製したいのですが、
その方法で、以下の2通りを考えているのですが、どちらが効率がよいか、あるいはより効率の良い方法などありましたら、ご教授ください。

@グルタチオンセファロース4Bを加えてrotatorを用いてGST-fusion proteinをそのビーズに結合させる。

Aグルタチオンセダロース4Bをカラムに充填して、そのカラムにを用いてGST-fusion proteinを通して、ビーズと結合させる。
(カラムに通す流速は自然落下にしています。)

最後にビーズを遠心後、sample bufferを加えて上精を試料とします。
 
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(無題) 削除/引用
No.3793-2 - 2011/01/10 (月) 22:16:55 - C
どっちでもそんなに極端な違いはないと思いますが、あえて言えば

1.(長所)それなりの時間インキュベートするため結合量/回収率が増すかもしれない。
 (欠点)(低温かつインヒビター入れればある程度は抑えられるかもしれないけど)共存するであろう各種proteinaseによる分解を受ける危険があるかもしれない。精製物の生物活性をみるような目的だと活性低下などが起きる可能性もあるかもしれない。

2. (長所) きょう雑蛋白質とすみやかに分離、精製できるため、proteinaseによる分解や、活性低下などの危険は回避しやすい。
(短所) 流速が速いと回収率が低下しやすい。

せっかくGSH-columnで精製するのだし、溶出はグルタチオンでやった方が精製度は高まると思う。SDS-sample buffer でやると非特異的にビーズにくっ付いたりカラムに引っかかった微細な不溶化物とかもみんな一緒に出てくるからコンタミが増えてしまうから。

GST-fusion proteinの精製法について 削除/引用
No.3793-1 - 2011/01/09 (日) 20:13:46 - グルタチヲン
GST-fusion proteinを質量分析にかけるため、大量抽出を行っております。
約100mLのタンパク抽出液からGST-fusion proteinを精製したいのですが、
その方法で、以下の2通りを考えているのですが、どちらが効率がよいか、あるいはより効率の良い方法などありましたら、ご教授ください。

@グルタチオンセファロース4Bを加えてrotatorを用いてGST-fusion proteinをそのビーズに結合させる。

Aグルタチオンセダロース4Bをカラムに充填して、そのカラムにを用いてGST-fusion proteinを通して、ビーズと結合させる。
(カラムに通す流速は自然落下にしています。)

最後にビーズを遠心後、sample bufferを加えて上精を試料とします。

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