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ありがとうございました。 削除/引用 No.3811-20 - 2011/01/20 (木) 11:38:23 - 勉強中 たくさんの回答をいただきありがとうございました。 多忙で月に1度しか会えない指導者に なんとか時間を作ってもらえそうなので確認ができそうです。 みなさんのアドバイスを基にいい結果が出せるよう がんばります。 ありがとうございました。

ありがとうございました。 削除/引用 No.3811-19 - 2011/01/20 (木) 11:35:14 - 勉強中

つまり 削除/引用 No.3811-18 - 2011/01/17 (月) 17:45:24 - わ 1. 遠心のときのブレーキオフ。 2. 丁寧に、やさしくピペッティングする。 重要なのはこの2点のみ！ 生存率が良くなるまで繰り返す！ ようするに練習あるのみです。

(無題) 削除/引用 No.3811-17 - 2011/01/15 (土) 11:39:36 - ami > 割合まで必要だと思わず省いてしまいました。 > 『組成』というのはそこまで書く必要があったんですね・・・。 って自分で書いてるんだから、組成書いてよ･･･

ami さん 削除/引用 No.3811-16 - 2011/01/15 (土) 11:22:20 - あのさ >バッファーの組成書いてっていってるのに･･･それぞれの濃度を書かないと >誰もわからん。。。 って。 主さんは初心者で ”どこまで書けば良いかなどもわからず トピのような質問になってしまいました。お恥ずかしいです。” って書いてるんだからそうやって突っ込むのやめましょうよ。 自分だってそういう時期はあったでしょう。 「なるほど。こういう場ではここまで書くんですよ」 とか言えないものでしょうか。

横やりですみません 削除/引用 No.3811-15 - 2011/01/15 (土) 07:36:07 - 脂肪 私もマウスで挑戦してますが、生存率が８０％を超えることはめったにないです。 生存率５０％以下でも実験に使っちゃってます・・・それって良くないんですね・・・ 今後改善したいです。 ところでマウスって門脈から灌流できるんですか？ 細すぎて無理だと思ってました。 私は下大静脈の肝臓の真上をクランプして真下の位置にペリスタポンプにつないだ針を刺して、門脈を切って灌流しています。 色々勉強になります。ありがとうございます。

生存率には影響しないかもしれませんが 削除/引用 No.3811-14 - 2011/01/15 (土) 00:53:24 - かさ 遠心するときブレーキをオフにしてますよね？ 遠心機によると思いますが、 弱い遠心ですのでブレーキかけると綺麗に沈殿しなかったですよ。

そういえば 削除/引用 No.3811-13 - 2011/01/14 (金) 22:18:00 - チョコパイ bufferといえば、コラゲナーゼ溶液の組成は？ コラゲナーゼのグレードにもよりますが、トリプシンインヒビター入れてますか？ amiさんが再三いっているように、buffer類の組成は示さないと。 1、前灌流液 2、コラゲナーゼ溶液 3、細胞懸濁液 濃度も含めて。 特殊なものを使ってないなら、示せないことはないハズ。

だから 削除/引用 No.3811-12 - 2011/01/14 (金) 19:56:06 - ami バッファーの組成書いてっていってるのに･･･それぞれの濃度を書かないと誰もわからん。。。

(無題) 削除/引用 No.3811-11 - 2011/01/14 (金) 19:21:15 - チョコパイ 遠心力と温度は同じです。 細胞自体は、たくさんとれるハズなので、なるべく軽く遠心して、死細胞（おそらく細胞が壊れて軽くなっている）を除くようにしていました。 十分な量のbufferに懸濁してますよね？ 上清の濁りが強いというのは、明らかに細胞っぽいparticleがまだ残っているという感じですよね？ 灌流時間は、コラゲナーゼは様子見なので、なんともいえませんが、大体それくらいだと思います。（コラゲナーゼのbufferの問題ではなさそうですね）どの程度こなれているかというのは、文章では説明できないので、実地に誰かにみてもらってください。（やりすぎても、こなれてなくてもよくないので） ピペッティングについては、時間をかけずに丁寧にしっかりやるところです。 洗浄回数も3回です。 ちなみに、その際使用するbufferは何を使っていますか？ そうそう、どなたかが尋ねていたと思いますが、生存率はどうやって求めているのですか？トリパンブルー染色？ ここまででわかっている情報からでは、とても生存率が５０％程度とは思えないのですが。。。

チョコパイさま 削除/引用 No.3811-10 - 2011/01/14 (金) 18:33:44 - 勉強中 お返事ありがとうございます。 >�@当然、コラゲナーゼ処理というのは、肝灌流してるとは思いますが >その際に灌流が始まるまでにマウスが死んでしまってないでしょうか？ 門脈から潅流液を流し始めてすぐに下大静脈を切り この時点で失血死をします。 それまでの麻酔の調整もうまくいっていると思います。 >灌流している時間は、適切でしょうか？ 前潅流液が約7分、コラゲナーゼが約10分（様子を見て調整）です。 >�A遠心は、１分で十分だったような。 細胞の沈殿が不充分（上清が濁りが強い）の気がしていましたが そんなに軽くで良いんですね。 ちなみに遠心力と温度は大丈夫でしょうか。 あと、トピ�Cの洗浄回数は多いでしょうか（細胞への負担が心配） >�Bピペティングは、丁寧にしてますか？ >あと、各操作は手際よくやっていますか？ ”丁寧にやる＝時間がかかる”・・と、細胞へのダメージが 心配で軽くやっていました。これも原因でしょうか。 （口径が大きめのピペットを使っています） 操作は手際よくやれていると思うのですが・・。 >�Cただ、生存率が５０％くらいということは、もっと根本的なところに >原因があるような気がします。（適当にやってももっと生存率はいいですぞ） ですよね・・（涙） ご指摘いただいた点を気をつけて再度チャレンジしてみます。 上記についてまたアドバイスいただけると幸いです。

余計なおせっかいかもしれないが。。。 削除/引用 No.3811-9 - 2011/01/14 (金) 17:25:58 - チョコパイ ずいぶん昔にラットの肝細胞をとっていましたが、プロトコールにそれほど違いはないと思いますので参考までにコメントします。 �@当然、コラゲナーゼ処理というのは、肝灌流してるとは思いますが、その際に灌流が始まるまでにマウスが死んでしまってないでしょうか？ 灌流している時間は、適切でしょうか？ �A遠心は、１分で十分だったような。。。 �Bピペティングは、丁寧にしてますか？これで結構生存率は変わってきます。 あと、各操作は手際よくやっていますか？ �Cもう少し生存率がよければ、パーコールで生存率が若干よくなることもあるが。。。無理か ただ、生存率が５０％くらいということは、もっと根本的なところに原因があるような気がします。（適当にやってももっと生存率はいいですぞ） 基本的には、９０％以上でないと実験にはならないでしょう。私のところでは、９５％が合格ラインでしたが。 これ以上は、皆さんが指摘しているように、もう少し細かい情報がないと、問題は解決しないのではないでしょうか。

ありがとうございました。 削除/引用 No.3811-8 - 2011/01/14 (金) 15:59:30 - 勉強中 >バッファー組成。なぜ割愛するのか分かりませんけど。 割合まで必要だと思わず省いてしまいました。 『組成』というのはそこまで書く必要があったんですね・・・。 >生存率の決定方法は？ 単純に全細胞数中の生細胞の割合として出しています。 ・・・と、 既にお気づきだと思いますが、”まったくの初心者”で 名前につけたとおり、勉強中の身です。 ですので、どこまで書けば良いかなどもわからず トピのような質問になってしまいました。お恥ずかしいです。 前任者からは簡単な引き継ぎがあったのみで、手元にあるマニュアルに沿って やっています（前任者も曖昧な状態だったようで聞けません） ネットで調べてもわからず、こちらで質問させていただきました。 説明不足なトピになってすみません。

あぁあと 削除/引用 No.3811-7 - 2011/01/13 (木) 19:45:12 - ami コラゲナーゼ処理の詳細。

(無題) 削除/引用 No.3811-6 - 2011/01/13 (木) 19:43:32 - ~ 脳のラボ出身で肝臓での条件は見たこともありませんが。 >各工程でお気づきの点などありましたらぜひ教えて下さい。 各工程以前の話ですが、まず始めに気づくのは、書かれている情報だけで貴方と全く同じ操作を出来る人は皆無である点だと思います。 その様な情報の中に改善すべきところがあるかを聞いても、根本的にプロトコルを読み間違えているのでない限りは改善点を見つけ出すことは出来ないでしょう。 情報が足りないという上記の話とは矛盾しますが、おそらくは何かちゃんとしたプロトコルを見て行なっているでしょうから、どこかの手技の問題であってプロトコルの問題では無いと思います。 経験者のところで一緒にやらせてもらうのが一番早い改善方法かと思います。

一番怪しいのは 削除/引用 No.3811-5 - 2011/01/13 (木) 18:55:05 - ami バッファー組成。なぜ割愛するのか分かりませんけど。 生存率の決定方法は？

ありがとうございます。 削除/引用 No.3811-4 - 2011/01/13 (木) 15:11:55 - 勉強中 まとめてのお返事になってすみません。 >遠心分離時の遠心力，時間，温度は． 50G、2分間、4℃　です。 時間が短い気がするのですが・・・。 >生存率が悪いってどれぐらいですか現時点では？ 実験に使うには80〜90％が良いとのことですが 現在、平均してだいたい50％くらいです。 >�Bで添加しているbufferの組成は？ 割合は省きますが、 HEPES、KCl、NaCl、NaH2PO4、D-glucose、CaCl2　です。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3811-3 - 2011/01/13 (木) 14:28:59 - sin 遠心分離時の遠心力，時間，温度はどれくらいでしょうか．

(無題) 削除/引用 No.3811-2 - 2011/01/13 (木) 14:23:18 - metk 生存率が悪いってどれぐらいですか現時点では？ �Bで添加しているbufferの組成は？

細胞の分離法について教えて下さい。 削除/引用 No.3811-1 - 2011/01/13 (木) 13:45:38 - 勉強中 マウスの肝細胞（生細胞）を使って実験をする予定なのですが 細胞の生存率が悪いのでなかなか進みません。 以下のとおりですが、訂正点、改善すべきところを教えていただけると幸いです。 �@ コラゲナーゼ処理をした肝臓を取り出し、buffer内で細断（氷上） �A メッシュフィルターにて濾過 �B 遠心→上清を除去→bufferを添加 �C �Bを3回くらい繰り返す。 簡単に書きましたが、上記のように行っています。 各工程でお気づきの点などありましたらぜひ教えて下さい。 よろしくお願いします。

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