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ありがとうございます 削除/引用 No.3815-12 - 2011/01/15 (土) 11:26:55 - メイキ 皆さん、いろいろと情報どうもありがとうございます。染めたい抗体は結構の数があるので、これから試行錯誤でやっていきたいと思っております。引き続きご支援の方、宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3815-11 - 2011/01/15 (土) 10:08:41 - Boston-Pullman 私の場合、灌流固定せずに新鮮な大腿骨を４％PFAに４℃２４時間固定後、EDTA処理（濃度は忘れました）４℃２４時間にて脱灰しました。その後はスクロース、OTC包埋です。 問題だったのは免疫染色中に骨の部分がスライドから剥がれてしまうことでした。それならば最初から骨髄だけ取り出してサンプルを調製すればよいと思い、それ以降骨なしの凍結切片を使って実験していました。

To Boston 削除/引用 No.3815-10 - 2011/01/15 (土) 09:35:07 - メイキ 失礼しました。目的は骨ごと切って、骨髄を観察することです。すなわち、実際見たいのは骨髄ですが、骨ごと切っています。 今まで肝臓で骨を包埋して切片を作ってきたのですが、うまくいかないこともありまして、灌流固定後OCT包埋でやってみたいところです。 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3815-9 - 2011/01/14 (金) 13:20:21 - Boston-Pullman タングステンでした。失礼しました。 何処でもではないです。論文検索すればちゃんとメソッドも書いてあります。研究室名をあげるのは問題ありますので。医学部のある(病理とか)大学なら共有機器もしくはcore facilityにあると思います。 簡単な対処法を書いておきましたが、どうでしょうか？骨ごと切らないといけないのでしょうか？それとも骨髄ではなく、骨を解析したいのでしょうか？目的が書かれていなかったので骨髄だろうと推測してコメントしました。

(無題) 削除/引用 No.3815-8 - 2011/01/14 (金) 11:59:59 - メイキ チタン製の歯で大腿骨の凍結切片は、血液幹細胞を研究しているラボなら、どこでもできる技術ですか？ 少し具体的に、大腿骨を丸ごとチタン製の歯にはめてから切ることですか？こっちは肝臓で大腿骨を包埋した後切っていますが。。。

(無題) 削除/引用 No.3815-7 - 2011/01/14 (金) 11:49:00 - Boston-Pullman 血液幹細胞の研究をしているラボへ行って、チタン製の歯で大腿骨の凍結切片をつくるのをお勧めします。固定も脱灰の必要もないはずです。 私は近くにそのようなラボがなかったので、骨髄を崩さないように取り出して、短時間固定してから凍結切片を作成していました。骨ごと切るために、EDTAやTCAなども試しましたが、きれいな染色像は得られませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3815-6 - 2011/01/14 (金) 11:07:38 - ~ ラボにある材料・機材でこれが出来るので、この条件で試してみますがどうですかという質問であれば、悪いプロトコルではないと思います。 これで問題が生じる余地がありますかという質問であれば、危なそうなところはあると思います。 >凍結切片は自分たちで切れます 自分で切れると、きれいな切片が切れるは無関係なので、問題がないとはいえません。 骨は切片作製が難しい組織に含まれると思いますので、形態保存としては劣っている凍結切片できれいに切れるのか心配です。 >4%PFA（灌流）固定で問題ないですね？ 抗原性が失われにくいという意味のみであれば、first choiceとしては問題ないと思います。 ただ、機械的強度があまり得られないことが切片作成時に不利に働くかもしれません。 また、シュクロース浸透は書いていないだけですよね？ 机上で考えていてもきりがありませんし、 書かれているのと似たようなプロトコルで骨を見れている報告もあるみたいですので、 一度やってみて、結果を見てから改良が必要か考えるのが早いと思います。

ご返答ありがとうございます 削除/引用 No.3815-5 - 2011/01/14 (金) 10:07:45 - メイキ 4%PFA灌流固定、4%PFA固定、EDTAで脱灰、OCT 包埋、凍結切片作製の予定です。また、CryoStat機械があるので、凍結切片は自分たちで切れます。 染めるのは全てタンパク質なので、4%PFA（灌流）固定で問題ないですね？ 以上、宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3815-4 - 2011/01/14 (金) 09:29:09 - ~ 骨をやっていた先輩は固定、脱灰後に、パラフィン包埋や凍結切片を作っても組織が崩れてしまったために、何かのコンパウンドで包埋して切片を作っていました。 1回試すのであれば手持ちの材料でやってみるのはいいと思いますが、 トラブルが起きた場合には、固定や切片の作成法も検討が必要になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3815-3 - 2011/01/14 (金) 03:57:15 - 通りすがり 　大たい骨の切片を切る場合、EDTAなどで脱灰する予定はありますでしょうか。以前に知人が関節の切片を作成するときに、かんりゅう固定後にEDTA（濃度は忘れた）を２時間ほどかんりゅうさせていました。 　EDTAのかんりゅうが必要ならば、PFAをかんりゅうさせることもたいした手間にはならないと思います。 　もちろん、強い固定で染まらなくなる抗原というものも存在しますから、そういった意味ではかんりゅう固定しないほうが良いという可能性もありますが。

(無題) 削除/引用 No.3815-2 - 2011/01/14 (金) 01:22:56 - tani 固定方法は免疫染色の抗体によりますが、それ以前に、大腿骨の凍結切片を作ることは大丈夫ですか？

大腿骨の凍結切片作製のために、灌流固定は良い選択？ 削除/引用 No.3815-1 - 2011/01/13 (木) 17:49:28 - メイキ マウスの大腿骨の凍結切片を作製し免疫染色を行う予定ですが、マウスをさばいた後４％PFAなどで固定を行った方がいいか、或は灌流固定した後４％PFAなどで固定を行った方がいいか、教えて頂けますか？宜しく御願い致します。

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