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(無題) 削除/引用 No.3841-15 - 2011/01/25 (火) 09:39:55 - メイキ >amiさん ご意見どうもありがとうございます。 　産生でも分泌でもなく、あるcytokineを産生或は分泌していると知られている細胞のマウス生体からの回収・処理・解析です。 　そうですね、誤差を恐れでは実験なんかできないですね。試行錯誤でやってみます。 ＞~さん 　プロトコールどうもありがとうございます。また、タイムコースをふってみることはとても面白いですね。凍結切片およびパラフィン切片の免疫染色も進めております。そして、自分なりのプロトコールを作製してみます。ご意見どうもありがとうございます。 ＞Actiasさん 　同感です。免疫染色も同時に進行させております。ご意見どうもありがとうございます。 ＞まっくろん 　vivo（マウス）から取って来た細胞の解析です。個人的な不安も疑問もあるんですが、一応キットを優先に考えてみます。ご意見どうもありがとうございます。 ＞長崎の田舎者 　vivo（マウスの骨髄から）の実験で、移植（刺激？）後の解析になります。ご指摘とおり、mRNAは確実に見る予定です。また、蛋白レベルは難しいかも知れませんが、FACSと免疫染色を合わせて解析を進めてみます。ご意見どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3841-14 - 2011/01/21 (金) 11:11:51 - ~ 前提として、過去の報告の中に貴方が納得できるだけの検出方法はないのですよね？ 処理による測定結果への影響を避けたいというのは誰でも考えることで、それにも関わらず薬剤処理等をしてから検出している報告があることをどのように受け止めているのか疑問です。 貴方は新しい検出方法を確立しようとしていることになりますので、その検出方法が妥当であるかは、あなた自身が示す必要があるでしょう。 そのため、 >細胞に何か変化が起きてFACS解析で正確にデータを示せない可能性 を潰すのは貴方の研究の一部でしょう。 変化が起きていないことを示すやり方としては、タイムコースを取って長期間ポピュレーションに変化が無いことを示すなど間接的に示すやり方はあります。 他の検出法（例えば凍結切片→IHC）でも比率が同じであることで示すこともできるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3841-13 - 2011/01/21 (金) 09:47:11 - ami > マウスの骨髄から回収した細胞の中のCytokine 分泌細胞の割合をFACSで正確に解析したいです。 > しかし、回収の間、細胞に何か変化が起きてFACS解析で正確にデータを示せない可能性は十分あるのでは？そもそも割合も少ない細胞なら、少しでも誤差が入ると、尚更データが信頼できないと思いますが。。。 誤差っていうのが何を言いたいのか分からないけど、何を測定するときでも、測定という操作が誤差を生じさせる･･･それがいやなら実験なんてできないわけで。 何があなたの本当の懸念なのかがわからない。

(無題) 削除/引用 No.3841-12 - 2011/01/21 (金) 09:26:05 - メイキ マウスの骨髄から回収した細胞の中のCytokine 分泌細胞の割合をFACSで正確に解析したいです。 しかし、回収の間、細胞に何か変化が起きてFACS解析で正確にデータを示せない可能性は十分あるのでは？そもそも割合も少ない細胞なら、少しでも誤差が入ると、尚更データが信頼できないと思いますが。。。

ここらでコメントしておくと 削除/引用 No.3841-11 - 2011/01/20 (木) 18:50:29 - ami 質問者の理解が進んでいるか非常に疑問ですが、とりあえず、 ○ 分泌を見たいのか、産生を見たいのかははっきりさせておくべき ○ in vivoでも、産生をFACSで見る方法は普通にある とだけ。

Chemokine の免疫組織染色（パラフィン切片）時、抗原賦活の必要性は？ 削除/引用 No.3841-10 - 2011/01/20 (木) 15:52:03 - メイキ Chemokine の免疫組織染色（パラフィン切片）を行っているんですが、より良い発現パターンを出すためには抗原賦活は必ずしも必要なんですか？もし必要でしたら、どういった方法が好ましいですか？或は、case by case で試行錯誤が必要ですか？ 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3841-9 - 2011/01/20 (木) 08:23:42 - 長崎の田舎者 私も以前細胞からのサイトカイン分泌を調べたく、方法を検索しましたが、以下のような方法があると思います。T細胞と仮定して話をします。 １．in vivoからとってきた細胞をそのまま使いたい場合：in vitroで刺激をしない限り、恐らく蛋白レベルでは無理です。RT-PCRで各サイトカインのmRNAレベルを測定するしかないのではないでしょうか。 2．in vitroで刺激をする場合： 2a. 既にeffectorに分化した細胞からのサイトカイン分泌を見る方法として、T細胞か脾細胞をPMAとionomycinで4〜5時間刺激し、その間「まっくろん」さんも言っているように、brefeldin Aかmonensinでサイトカインを細胞内に蓄積させ、細胞内サイトカインを染め、FACS解析をする方法があります。これにはいろんな会社からキットみたいなのが販売されています。また、CD3抗体とCD28抗体で刺激する方法もあるようですが経験ありません。 2b. 抗原特異的なサイトカイン分泌を見る方法としては、脾細胞を抗原蛋白・ペプチドで数日培養し、上清中のサイトカインをELISAで測定するか、ELISPOTをやることができます。ELISAキットもEPISPOTキットもいろんな会社から販売されています。

マウスからです 削除/引用 No.3841-8 - 2011/01/19 (水) 10:05:58 - メイキ vivoから取ってきた細胞をそのまま検出したいです。in vitroの原理のままやってみてもいいかもしれませんが、何となく不安です。

(無題) 削除/引用 No.3841-7 - 2011/01/19 (水) 09:58:01 - まっくろん 　この実験は、vitroでサイトカイン産生を誘導して見るものでしょうか？それとも、vivoから取ってきた細胞をそのまま検出するというものでしょうか？ 　前者であれば、サイトカイン産生誘導時にbrefeldin Aかなんかで細胞内に蓄積させて、310さんがご指摘のように細胞内サイトカインとして検出できそうです。後者であれば・・・、そのまま膜透過処理して検出するしかないですかね。あまりいい案が浮かびません。

(無題) 削除/引用 No.3841-6 - 2011/01/19 (水) 04:21:41 - 310 The authors of "Parasite Immunology, 2006, 28,221-228" used below kit. http://www.bdj.co.jp/reagent/articles/1f3pro00000w2cpi.html

(無題) 削除/引用 No.3841-4 - 2011/01/18 (火) 22:45:48 - Actias 免疫染色で顕微鏡でも見ておいたほうが良い。 「細胞のここに検出されるから、FACSは有効な解析方法です」 と、つっこみに対して反論できるかどうか。 見たいものが見えている手法であれば、問題ない。

(無題) 削除/引用 No.3841-3 - 2011/01/18 (火) 16:56:05 - ~ http://www.miltenyibiotec.co.jp/jp/NN_675_Cytokine_Secretion_Assays.aspx 原理がどこに書いてあるのか分からないのですが、キットが売られているくらいですから、対応しているサイトカインであれば難しくはないのでは。

それは 削除/引用 No.3841-2 - 2011/01/18 (火) 16:36:41 - ami 大いにサイトカインの種類による。簡単なのは簡単。nonsenseでは全くない。

Cytokine 分泌細胞のFACS解析はnonsense ? 削除/引用 No.3841-1 - 2011/01/18 (火) 14:36:08 - メイキ あるCytokine 分泌細胞の割合をFACSで解析しようと思っていますが、かなり難しいことですか？可能でしたら、解析時、何を注意すれば良いですか？或は、定量的解析を行いたければどういう方法が一番ですか？ ちなみに解析は蛋白レベルで、解析細胞は骨髄の細胞になります。

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