全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3842-8 - 2011/01/20 (木) 04:49:48 - 310 >自家蛍光はどのように解消しているのでしょうか。 昔、一緒に働いていた先生の話では、目には見えないほど赤外線に近い長波長の蛍光を使うと良いという話でした。が、これは彼のサンプルでの一例なので、抗体なしのスライドで励起波長と検出波長（excitation&emission)を変化させ、自家蛍光の有無と出にくい波長の組み合わせを調べ適切な蛍光色素を選んでください。 自家蛍光を下げると言われる、スーダンブラックを使ったことがありますが、全体的に感度が下がるため、抗体由来のシグナルが強くないと、検出不能になります。スーダンブラックを使う代わりに写真撮影の露光時間を自家蛍光が気にならないほどに落とすのも一つの方法です。いろんな抗原賦活化を試したり、TSA法などで抗体由来のシグナルを増加させるといいかもしれません。 励起波長を長時間あてて、自家蛍光を褪色させる方法も試しましたが、私の場合、褪色後数時間後に強烈な自家蛍光が再度生じてしまいました。 自家蛍光の解消は私にとっても興味深いテーマですので、識者の意見をお待ちしています。

(無題) 削除/引用 No.3842-7 - 2011/01/19 (水) 08:24:27 - imuimu みなさん 貴重なご意見ありがとうございます。 ご質問にお答えします。 >２次抗体のみのスライドでも目的の細胞がばっちり染まってしまいます。 >ちなみにこの1次抗体を用いて免疫染色を行うと目的の場所にきちんと発色があり、2次抗体のみでは何も染まりません というのは、ＡＰさんのおっしゃるとおり、発色法（ＤＡＢ）ではうまく染まるのに、蛍光抗体法では二次抗体だけでも非特異的な染色が起きてしまうということです。 蛍光標識は Alexa594 goat anti-Rat IgG（1000倍希釈） Alexa488 goat anti-Rabbit IgG（5000倍希釈） を使用しています。 2次抗体なしというコントロールは見てなかったので、次回試してみます。 また、ブロッキングを10％にして、４℃オーバーナイトも試してみます。 洗浄液にＢＳＡを加えていたのは、参考にした教科書に書いてあったのをそのまま使用しました。 ＰＢＳだけでも大丈夫なのですね。 ありがとうございます。 自家蛍光だというご指摘がありましたが、みなさんは自家蛍光はどのように解消しているのでしょうか。 どうぞ宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3842-6 - 2011/01/18 (火) 23:25:02 - ABZO そのバックグラウンドって自家蛍光の可能性とかどうよ。

(無題) 削除/引用 No.3842-5 - 2011/01/18 (火) 18:38:01 - AP 先のかたが指摘されているように、 >２次抗体のみのスライドでも目的の細胞がばっちり染まってしまいます。 >ちなみにこの1次抗体を用いて免疫染色を行うと目的の場所にきちんと発色があり、2次抗体のみでは何も染まりません と、そのままでは意味がわからない記述がありますが、、、、 想像するに、発色法ではうまく染まるのに、蛍光抗体法では二次抗体だけでも非特異的な染色が起きているようだということでしょうか。 情報として必要だと思うのは、 Q1. 発色法は何を使ったか、蛍光標識は何か Q2. 一次、二次抗体の特性について（由来動物、ポリクロ/モノクロ、whole/fragment、など） 現段階で、ひとつ疑われるのは、 >２次抗体のみのスライドでも目的の細胞がばっちり染まってしまいます。 これが自家蛍光ではないかということです。二次抗体なしというコントロールは見ていますか？

(無題) 削除/引用 No.3842-4 - 2011/01/18 (火) 16:42:36 - 千 パラフィン切片での蛍光染色を通常行っている者です。 私も質問させていただきますが、洗浄液にBSAを入れているのはなぜですか? PBSのみでいいのでは? 蛍光染色の場合、バックグランドが高い時に私が行うのは、 ・ブロッキングの正常ヤギ(うちのラボではDonkeyですが)血清の濃度を5%から10%にあげる。(室温30分〜1時間) ・一次抗体の濃度を下げる。 のどちらかでだいたいは解決しています。 二次抗体は、私のラボではAlexaやCY3やFITCで、どれもx200で使用し、こちらは濃度を変更することはほぼありません。 二次抗体の希釈濃度がかなり高そうですが、種類は何でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3842-3 - 2011/01/18 (火) 16:34:56 - ラスカル 蛍光の色素は何を使用されていますか？ 私も以前Alexa488でnegative controlが出てしまい困ったことがありました。 組織にもよるようですが、ブロッキングbufferを変更して解決（減少）しました。 あと、AAさんがおっしゃっている通り１次抗体の濃度を薄くして長時間反応させるほうがバックグランドがたかくなりにくいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3842-2 - 2011/01/18 (火) 15:07:04 - AA すいません、質問を返すようで申し訳ありませんが ＞２次抗体のみのスライドでも目的の細胞がばっちり染まってしまいます。 とあるのに ＞ちなみにこの1次抗体を用いて免疫染色を行うと目的の場所にきちんと発色があり、2次抗体のみでは何も染まりません。 というのはどういう事でしょうか？ 凍結切片ではうまくいくということでしょうか？ 個人的な経験ではパラフィンの場合、賦活化が非常に重要でした。 私はクエン酸バッファーで、90℃25分やはオートクレーブ105度10分などの条件を使用したことがあります。 非特異が高いということですが、一次抗体を4℃over nightなどにしては二次抗体の時間を縮めてみるなどは試されましたか？

パラフィン切片での免疫蛍光染色 削除/引用 No.3842-1 - 2011/01/18 (火) 14:56:11 - imuimu いつも勉強させていただいております。 染色初心者です。 どうぞ宜しくお願いいたします。 パラフィン切片で多重蛍光染色を行いたいと思い、目的の抗体２つをそれぞれ単独で染めて条件検討を行っていますが、バックグランド？非特異染色？が高くて困っています。 ２次抗体のみのスライドでも目的の細胞がばっちり染まってしまいます。 手順は 脱パラ 抗原賦活化（クエン酸バッファー） 洗浄（0.1%BSA-PBS、5分×1回） ブロッキング（５％正常ヤギ血清、室温、1時間） 1次抗体反応（室温、1時間） 洗浄（0.1%BSA-PBS、5分×３回） ２次抗体反応（室温、1時間）（濃度は1000〜5000倍希釈） 洗浄（0.1%BSA-PBS、5分×３回） ちなみにこの1次抗体を用いて免疫染色を行うと目的の場所にきちんと発色があり、2次抗体のみでは何も染まりません。 用いた1次抗体はデータシートには蛍光染色適用とあります。 事情がありまして凍結切片での染色は考えておりません。 どなたかパラフィン切片で蛍光染色の経験がある方、 教えていただけないでしょうか。 どうぞ宜しくお願いいたします

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---