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(無題) 削除/引用 No.3868-10 - 2011/01/24 (月) 17:37:57 - B5 ＞中年さん あることは知っていたのですが、まさかこんなに落ちるとは思ってもいなかったもので。 １年前に、OverExpress コンピテントセルというのを購入したのを思い出したので、まずはこれに形質転換してみます。 http://www.cosmobio.co.jp/product/bunshiseibutsu/cat384/cat391/01220008.asp?entry_id=2770 ウイルスなどの毒性タンパク質の発現にも適していると書いてあるので。

(無題) 削除/引用 No.3868-9 - 2011/01/24 (月) 16:14:28 - 中年 一般論として、たとえ30a.a.程度のタンパク質（ペプチド？）を融合しただけでも発現量が著しく低下するということはあり得ることです。GFPではありませんが、GST融合タンパク質ならば、融合で収量が下がったということ経験をお持ちの方は多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3868-8 - 2011/01/24 (月) 15:54:20 - B5 ＞~さん 大腸菌の系しか確立していないもので、無細胞系は今後考慮に入れようと思います。 いちお、配列は見てみましたが、プロモーター部位は問題ありませんでした。全配列を確認した訳ではありませんが。

(無題) 削除/引用 No.3868-7 - 2011/01/24 (月) 15:27:14 - ~ だめもとで、不溶性画分を溶かして泳動してみたら、そちらにあったりしませんかね。 可溶性画分で見えないくらいだと望みは薄いと思いますが。 また、大腸菌で発現させること自体が目的なのでしょうか？ 他の発現系で発現させたタンパク質ではダメなのでしょうか？ 細胞を使わずに無細胞系であれば、毒性の影響は無いと思いますが。 ついでに、その発現しなくなった大腸菌からとったプラスミドの配列は元の配列と同じでしょうか？ 前に、デリーションしやすい配列を扱っていたときは、トランスフォーメーションしてプレートに撒いて、2mL程度のミニプレップをするまでの間にあらかた削れてしまったことがあります。 デリーションが原因であれば、株を変えたり培養温度を下げることで対応できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3868-6 - 2011/01/24 (月) 14:02:35 - B5 ＞~さん 発現量の蛍光量も落ちているので、難しいですね。 今までは、200 mLで十分量取れていたのですが、SDSで見た限りほとんどバンドが確認出来ないので、量を増やしても難しいと思います。 ただ、ライゲーション後もBL21に形質転換し直した時も、健康そうなコロニーが出来るというのが納得出来ないというか・・・。

実際に起きているのであれば、あり得るか聞いてもしょうがないのでは 削除/引用 No.3868-5 - 2011/01/24 (月) 11:57:06 - ~ >GFPが光らないということは 見ているのは発現量なのでしょうか？それとも蛍光量なのでしょうか？ 発現はしているが蛍光が見えないというのであればスペーサーは有効かもしれませんが、発現自体していないのであれば、スペーサーの効果は期待できないと思います。 また、そのタンパク質の必要量はどのくらいで、現時点での発現量でその量を得るには何Lの培養が必要なのでしょうか？ それが実施可能な量であれば、別にスペーサー等の検討は要らず、始めに設計しているデザインのタンパク質が使えるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3868-4 - 2011/01/23 (日) 17:16:00 - B5 ＞Boston-Pullmanさん やはり、ウイルス由来の配列なので大腸菌にとって毒性があるのでしょうかね。 ＞atsさん いちお、大腸菌での発現が最も良いコドンを選択しているのでその心配はないかと思います。 コロニーはできるけど、GFPが光らないということは、はやりインサートの配列が悪さしてるのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3868-3 - 2011/01/23 (日) 10:59:47 - ats 大腸菌であまり使われていないコドン（いわゆるレアコドン、対応するtRNAが少ない）が多く含まれている場合も、タンパク発現量が減少しますね。レアコドンが原因の場合は市販のレアコドンtRNAを補うplasmidを有する大腸菌を使うと、良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3868-2 - 2011/01/23 (日) 02:13:38 - Boston-Pullman 大腸菌にとって好ましくないたんぱく質の場合、あまり発現しない大腸菌コロニーが優位になります。

発現劇落ち 削除/引用 No.3868-1 - 2011/01/22 (土) 19:07:22 - B5 先日、「GFPにライゲーション」っていうトピックで質問したB5です。 緑と白のコロニーが出来たという質問だったのですが、結果ライゲーション出来たものと、セルフライゲーションでした・・・。多分コロニーをピックアップするときに２つ選択してしまったのだと思います（とても小さなコロニーを選択したもので）。 質問内容は変わるのですが、GFPに100 bpのインサートを入れるだけで発現が劇的に、異常に、低下したのですが、こんなことあり得るのでしょうか。 今回作製したベクター以外にも過去にGFPのN末に100 bpほどのインサートを導入したことはあるのですが、発現はほとんど低下しませんでした。 ちなみに、今回入れたいインサートの配列はHA-2ペプチドというものです。 http://www.nature.com/nm/journal/v10/n3/full/nm996.html 解決策としては、HA２とGFPの間にスペーサーを入れる等考えられるのですが。 N末ではなくC末にインサートを入れるというのは諸事情があり難しいです。

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