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(無題) 削除/引用 No.3870-16 - 2011/01/27 (木) 01:47:14 - ab > これまでに > ・タンパク質溶液に直接DMS > ・エタノール沈殿無し > と条件を変えてみましたが、結果に変化はありませんでした（Aはうまくいくが、Bはダメ） Trisバッファー中で架橋反応を行っていたので、Tris化（？）によってBの親水性度が変わってエタノール沈殿でロスしていたと思ったのですが、そうでもないようですね。 ひとまずリン酸バッファーを用いてうまくいくといいですね。 ちなみにTrisバッファーとリン酸バッファーでタンパク質の安定度に、それほど違いはないと思います（タンパク質によると思いますが）。

(無題) 削除/引用 No.3870-15 - 2011/01/26 (水) 18:13:20 - ｙｙｙｙ abさん ありがとうございます。 DMS止めるのにTrisを使うというのであれば、なおさらリン酸バッファーでやってみようと思います。 Tris、リン酸でバッファーの効果に何か大きな違いはあるのでしょうか？ （Trisを使っているのはゲルシフトのため） 私が知る分にはあまりタンパク質の構造保持に差が無いと思ってはいるのですが・・・ ＞エタノール沈殿をする必要 タンパクが濃縮されるのでバンドが見やすくなる、と捉えています。 参考にした論文があって、プロトコルはそれに沿っています。 これまでに ・タンパク質溶液に直接DMS ・エタノール沈殿無し と条件を変えてみましたが、結果に変化はありませんでした（Aはうまくいくが、Bはダメ）

(無題) 削除/引用 No.3870-13 - 2011/01/26 (水) 18:05:55 - ｙｙｙｙ yyyさん ありがとうございます。 精製したrecombinantです。 タンパク染色はCBB以外に銀染色をやってみたのですが、架橋なしでは新たに色々とバンドが見えてきたのですが、架橋ありの方ではまったくバンドが見えませんでした。 　 還元剤で切断出来る架橋剤も検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.3870-12 - 2011/01/26 (水) 17:54:15 - ｙｙｙｙ atsさん 色々ありがとうございます。 「Aが二量体になった」ということはSDS-PAGEによる確認で、単量体の倍の位置にバンドが来たこと、またAがロイシンジッパーであることから二量体を形成する”ハズ”ということから判断しています。 四量体相当のバンドは見られませんでした。上手くいきすぎなくらい良い結果が見られています。 ＞Tris-DMS複合体は悪さはしないと思いますが、Trisの濃度が高いのでタンパク-DMS-Tris複合体が出来て電荷が変わったとか??? ↓ これはあるかもしれません。Trisの挙動については考えていませんでしたので、やはりリン酸バッファーでやってみます。 DMSの濃度もふってみます。 ちなみに、反応時間を15分、30分、60分で変化させてみましたが、結果はたいして変わりませんでした。 うーん・・・・

(無題) 削除/引用 No.3870-11 - 2011/01/26 (水) 13:06:35 - rere 失礼しました。TEAさんの通りです。

(無題) 削除/引用 No.3870-10 - 2011/01/26 (水) 00:09:06 - TEA >[Re:9] rereさんは書きました : > Trisと同様にトリエタノールアミンもこの架橋材と反応すると思います。なぜバンドが消えたのかは分かりませんが。 Triethanolamineは一級アミンではないので、反応しないですよ。

(無題) 削除/引用 No.3870-9 - 2011/01/25 (火) 13:18:01 - rere Trisと同様にトリエタノールアミンもこの架橋材と反応すると思います。なぜバンドが消えたのかは分かりませんが。

(無題) 削除/引用 No.3870-8 - 2011/01/25 (火) 05:19:27 - yyy すみません、見当違いなレスしてしまったかも知れませんね。検出がimmunoblotとはどこにも書いてないですね。精製したrecombinantだったらタンパク染色の方が可能性高いですね。 　 還元剤で切断出来る架橋剤などを使ってみてはどうでしょうか？サンプルバッファーに還元剤有り無しで比べたら、大きすぎる多量体の可能性が否定出来るのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3870-7 - 2011/01/25 (火) 04:20:53 - ab atsさんの指摘通り、Trisを入れるとDMSによる架橋を抑制します。 通常、反応終了後に50 mMのTrisかグリシンを入れて未反応のDMSを不活化しますので、トリエタノールアミンかリン酸バッファーとかを使った方がよいと思います。 一つ疑問なのは、エタノール沈殿をする必要があるかどうかです。 エタノール沈殿をしないで電気泳動をしたことはあるでしょうか？ Pierceの説明書です。ご参考までに。 http://www.piercenet.com/files/0668dh5.pdf

(無題) 削除/引用 No.3870-6 - 2011/01/24 (月) 23:58:12 - yyy 抗体はモノクロですか？ エピトープ認識に必須のリシン残基があって、それが架橋剤によってマスクされるために反応しないという可能性はあるでしょうか？ その可能性があるとしたら、別のエピトープを認識する抗体を使ってみるという方法はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3870-5 - 2011/01/24 (月) 17:50:50 - ats 多量体化とも関係するのですが、Aがホモ「2量体化」したことの確認はSDS-PAGE(+/- western blot)で2倍の分子量になったことでしょうか。「4量体」に相当するバンドはないでしょうか。 > > Trisは使用しない方が良いのでは。> これは初耳でした。TrisとDMSが反応したせいで問題のタンパク質にも何らかの影響が出たのでしょうか・・・？ アミノ基（一級アミン）と反応しますよね？ピアスのManualにも記載されていたと思います(間違っていたらすいません）。もっともタンパクAではうまく行っているので、TrisとDMSの反応性は弱いのかもしれません。また、Tris-DMS複合体は悪さはしないと思いますが、Trisの濃度が高いのでタンパク-DMS-Tris複合体が出来て電荷が変わったとか??? 対策として、DMSの濃度を振ってみてはいかがでしょうか。例えば、1/125,1/25,1/5とか。

(無題) 削除/引用 No.3870-4 - 2011/01/24 (月) 16:07:00 - ｙｙｙｙ ＞atsさん アドバイスありがとうございます。 DMSについての情報が（ネットを含めて）乏しく、助かります。 > 多量体化、もしくは不純物と結合してゲルに入らないくらい高分子になっている可能性はありませんか？ ↓ 十分なSDS化作業をしていることや、ウェルにそれらしき残存物が見られないため、その可能性は低いように思います。 ちなみに、問題のタンパク質は単量体で、37kDaのサイズです。 　 > もともと沈殿しない程度に凝集していたりとか？ゲル濾過等で分子量は見たことはありますか？ ↓ ゲルろ過はまだですが、平行して行うつもりでしたので確認してみたいと思います。 > また、DMSによるクロスリンクにDMSと反応するTrisは使用しない方が良いのでは。 ↓ これは初耳でした。TrisとDMSが反応したせいで問題のタンパク質にも何らかの影響が出たのでしょうか・・・？ ゲルシフト等にも使っていたのでTrisですが、もともとはリン酸バッファーから透析で置換したものですので、対応できそうです。 後だしの情報となりますが、His-Tagがついているということは何かファクターとなりうるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3870-3 - 2011/01/23 (日) 15:25:31 - ats 多量体化、もしくは不純物と結合してゲルに入らないくらい高分子になっている可能性はありませんか？　 もともと沈殿しない程度に凝集していたりとか？ゲル濾過等で分子量は見たことはありますか？ また、DMSによるクロスリンクにDMSと反応するTrisは使用しない方が良いのでは。

クロスリンカー試薬の効果について 削除/引用 No.3870-1 - 2011/01/23 (日) 14:58:05 - ｙｙｙｙ クロスリンカー試薬（架橋剤）についてご意見賜りたいと思います。 2種類のbZIP型転写因子が二量体を形成する事を確認したいと思い、精製した組換えタンパク質を架橋剤でつなぎ、SDS−PAGEにて調べています。 この際、Aという転写因子はホモ二量体を確認できたのですが、BについてはSDS-PAGEで流すと、「何もバンドが確認出来ない」という現象が見られます。 事前に精製した際にSDS-PAGEでバンドがしっかり確認できています。 クロスリンカー試薬が特定のタンパク質を短時間で分解しきってしまう事があるのでしょうか？ 以下、反応条件です 200mM　トリエタノールアミン 40mM　スベルイミノ酸ジメチル をタンパク質溶液（0.5M NaCl 50mM Tris-HCl）に加え、室温で一時間 ↓ 三倍量の冷エタノールを加え、エタ沈 ↓ 遠心後、エタノールを除き、１×SDSサンプルバッファーで溶解し、10分間煮沸 比較に架橋剤無しを用いると、バンドは確認できます。

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