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あ！ 削除/引用 No.3875-8 - 2011/01/31 (月) 18:09:34 - たけ わかった！ 今度報告する！

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.3875-7 - 2011/01/28 (金) 15:51:54 - じょにー 参考にしている論文では、無固定の新鮮脳を-40℃のイソペンタンで２〜３分ほど急速冷凍して、その後40umの厚さで切片を作製しています。 yuさん；commentのように薄く切るのだと大丈夫かもしれないのですが、出来るだけ参考論文を再現できればと考えています。もし駄目でしたら、そうしてみます。ありがとうございます。 AAさん；OTC包埋後に凍結ですね、やってみます。確かに過剰冷凍しているかもしれません。もしくは過剰冷凍しているので、数時間クライオのなかで-18℃に静置しても、内部の温度が戻りきれていないのかもしてません。ただうちの設備では参考論文のように-40℃には出来ないので、困っています。 あさん；是非測ってみます。

(無題) 削除/引用 No.3875-6 - 2011/01/26 (水) 21:15:57 - あ 温度計で表面温度測ればいいじゃん -10だと粉々になる -25だとボロボロになる印象

(無題) 削除/引用 No.3875-5 - 2011/01/25 (火) 18:13:48 - AA タイトルと文面から無固定の標本を薄切したいのだと思いますが間違いないでしょうか？ ＞脳を取り出した後すぐにドライアイスで冷やしたイソペンタン中で急速冷凍 とありますが、薄切するのであればOCTなどの包埋剤を用いたほうが良いと思います。 脳を取り出し　→　包埋皿へ　→　OCTを上から入れ　→　イソペンタン中で凍結 PBS中でぼろぼろになるというのは切片作成時に既に壊れていると考えるほうが自然かと思いますので、薄切の際にダメージの少なくなるようにしてみてはどうでしょうか？ また過剰に凍結している場合、硬すぎるためか、切片に細かな傷が入りもろくなります。 このへんは感覚に領域になってしまいますが、指で少し表面を溶かして切る人もいます。

(無題) 削除/引用 No.3875-4 - 2011/01/25 (火) 17:25:29 - popo 失礼しました。クライオ内の温度、−１５℃です。

(無題) 削除/引用 No.3875-3 - 2011/01/25 (火) 16:27:25 - popo 固定の条件はどうでしょう？ きちんと固定ができていれば、５０μでも大丈夫です。 クライオ内の温度を∸１５℃くらいでスムーズに切れます。

(無題) 削除/引用 No.3875-2 - 2011/01/25 (火) 14:49:39 - yu 切片の厚さが40umは，厚すぎる気がしますがその厚さでやってある文献等が あるんでしょうか？ ちなみに私は，4umでやってます． あと，切片をつくった後に室温で数分静置して，切片中のコンパウンドが 飛んでからPBSで洗浄するようにしています．（あまり乾燥させると良くありませんが．．） この方法で行ってきて，いままで切片がボロボロになったり剥がれ落ちたことはありません．

新鮮凍結切片について 削除/引用 No.3875-1 - 2011/01/25 (火) 12:06:33 - じょにー お世話になります。 PND11のラットで、脳を取り出した後すぐにドライアイスで冷やしたイソペンタン中で急速冷凍しています。その後-20℃のクライオで40umの切片を作ろうとしたのですが、切片をPBSに入れると粉々になります。以前こちらのトピックで急激な温度変化がいけない旨のコメントをされてた方がいましたので、イソペンタンで急速冷凍した後、-80℃(ディープフリーザー)で数時間置き、その後クライオに移し、そこでも１時間ほど静置し、40umの切片を作製しました。これでもPBSに移すと切片は粉々になってしまいました。参考論文には詳細が記載ないため、これ以上の修正点が見つからないのですが、何かアドヴァイスありましたら教えてください。よろしくお願いします。

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