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(無題) 削除/引用 No.3879-8 - 2011/01/26 (水) 22:38:59 - AP それと、self-ligationとinsert同士の重合をどう防ぐかが問題になると思います。 lambda phage vectorの場合は別のトリックがありますが、プラスミドベクターの場合は、ベクターを脱リン酸化して、インサートに対して過剰量にするのがいいでしょう。 または、インサートをTaqで平滑化、一塩基Aの付加をしてTAクローニングするとか、ひと手間加えれば、self-ligationも重合も防ぐことができます。

(無題) 削除/引用 No.3879-7 - 2011/01/26 (水) 22:25:34 - AP >が、この方法で遺伝子をクローニング可能でしょうか？ >もしくは似たような方法をされた方はいらっしゃいますでしょうか？ 方法自体は珍奇なものではないです。 ゲノムライブラリーやcDNAライブラリーを作製するとき、インサートのサイズフラクションするために、ショ糖密度勾配超遠心やゲル濾過を使うのが古典的ですが、アガロースゲル電気泳動→切り出しでやることもあります。 >コロニーがうまく出ません。 どううまくないのかが書かれていませんが、異常にコロニー数が少ないとか、コロニーが出てもno insertばっかりという場合は、まずUV照射によるピリミジンダイマー形成が疑われます。

(無題) 削除/引用 No.3879-6 - 2011/01/26 (水) 22:16:17 - Actias ラムダZAP II にライゲーションするのも、pBluescriptII にライゲーションするのも、ともにやったことがあります。 うまくいきました。 書かれていることから考えても、特におかしいところは無いようですが。 ゲノムだろうがクローン化したプラスミドだろうが、ゲルからDNAを抽出してベクターにライゲーションするステップは、違いは無いと思います。 ラボでは、プラスミドから目的遺伝子を切り出して別ベクターに載せ替える操作は、うまくいっているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3879-5 - 2011/01/26 (水) 17:20:23 - ~ 最短で4kbのDNA断片が混ざっているのならば、ライゲーションはそれほど条件を考えなくてもいけそうな気がしますが。 市販のライゲーションキットを使っているのであれば、キットに含まれているPEGが高分子のDNAのライゲーションには不適切であるという話を聞いたことがあります。 キットではないT4 DNA ligaseとその添付バッファーでライゲーションすると、効率が向上するかもしれません。 また、違う制限酵素で切ったら、短い位置に来たりしませんかね。 最悪そのフラグメントだけで発現しなくても配列が分かれば、PCR用のプライマー設計に使えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3879-4 - 2011/01/26 (水) 13:42:04 - Boston-Pullman DNA とベクターは１種類の制限酵素で切断していますか？

(無題) 削除/引用 No.3879-3 - 2011/01/26 (水) 12:37:41 - ンンノ バクテリアのゲノム遺伝子をとりたいんでしょうか。 ｐＵＣ系のプラスミドベクターでは少しサイズが大きくて苦しいかもしれませんね。 日常的にそのサイズのDNA合成は断片をプラスミドに入れてる人なら可能かもしれ ませんが。 >ゲル注出を行わず、制限酵素処理しただけのサンプルを形質転換した場合はコロニーがたくさん出ています。 これがDNAライブラリーに相当しますが、この中にターゲットが含まれているか どうかは確認できますか？ ファージベクターのほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3879-2 - 2011/01/26 (水) 11:47:40 - ~ サザンでサイズを確認したら、新しくDNAを流しなおして切り出しているのですよね？ ゲルからの切り出しの際にUVをあてて、DNAをずたぼろにしていませんか？ 長いDNAはUVによるダメージを受けやすいです。 もし、回収するDNAに1秒以上UVをあてているのであれば、この点は見直したほうがいいと思います。 �@アガロース電気泳動 �Aマーカー（＋サンプルのウェルの端）部分を縦に切りとる �Bマーカー部分をEtBrで染め、UVをあてて位置を確認して目印を付ける �CUVを切った状態でサンプルとマーカーのゲルをくっつけて、必要な部分を切り取る で、回収するDNAにUVを当てることなく回収できます。

遺伝子のクローニング 削除/引用 No.3879-1 - 2011/01/26 (水) 11:27:53 - たか 遺伝子のクローニングを、cDNAライブラリーやDNAライブラリーを作成せずに以下のような方法で行っているのですが、コロニーがうまく出ません。 �@DNAを抽出し、制限酵素処理したのち、目的の遺伝子配列のプローブでサザンハイブリダイゼーションを行う。 �Aサザンハイブリダイゼーションでバンドが確認できた部分を、ゲル注出しインサートとして、pUC18/19ベクターにライゲーションする。 �Bライゲーション液をDH5α、もしくはE.coli HST8 premiumに形質転換する。 ゲル注出を行わず、制限酵素処理しただけのサンプルを形質転換した場合はコロニーがたくさん出ています。 ゲル注出し、インサートとしているDNAは4K〜8Kbp程度です。 この方法なら、目的遺伝子を含んだ断片に当たる確率が高いかと思って行っているのですが、この方法で遺伝子をクローニング可能でしょうか？ もしくは似たような方法をされた方はいらっしゃいますでしょうか？ 何分、遺伝子のクローニングが初めてで知識不足なため、何かしらのヒントをいただけたらと思います。よろしくお願いいたします。

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