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(無題) 削除/引用 No.3882-8 - 2011/01/28 (金) 06:23:50 - nao 御礼が遅くなり大変申し訳ありませんでした。 全体的に不勉強で、反省しております。 ＜masa様 当初80%ではなく、もっと少ない細胞数で染色していた時がありました。研究開始して間もなく、少ない細胞で陽性細胞数の多寡、違いがあっても手技によるものか不安であり、より多くの細胞で染色してみようと考えました。細胞密度によるcell cycleの影響の事は存じておりませんでした。これを考慮し、次回は細胞数を少なくしてみようと思います。 DAPIは使用し、全細胞数に対する比率は出すようにしております。FACSについてはTE処理も考えましたが、周期に影響するかもと思い込み、それ以上調べれておりませんでした。その目で見ると、色々な資料が出てきました・・・まずはPIを使用したFACSで細胞周期を見た後に、BrdUを使ったS期の評価についても考えてみようと思います。ありがとうございました。 ＜Actias様 接着細胞のFACSのプロトコル、大変参考になりました。自分で見つけるべきでした･･･ありがとうございました。 ＜ab様 確かに細胞が密集しており、更に、DAPIはそうでもありませんでしたがBrdU、p-Histonのほうで染色ムラが出て難渋しておりました。手技の向上についてはおっしゃる通りです。御指摘ありがとうございました。FACSで見る事をまず考えましたが、imageJでのカウントについても、再度、細胞数を少なくしてやってみようと思います。 ＜ut様 文献検索が不十分だったと猛省しております。コメントありがとうございました。 ＜う様 仰る通りでございます。指導者ともよく相談し、再度実験計画の見直しを行います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3882-7 - 2011/01/27 (木) 10:03:15 - う ＞陽性細胞をフローサイトメーターで見れたらと思いますが、浮遊細胞を使用するものなので、スライドに接着した細胞の計測は無理なんですよね？ 失礼ですが、このような知識をバックグラウンドとしている方は、 もう少しきちんと先輩や指導者に直接指導をしてもらった方がいいと思います。 ここで半端に知識をつけても生兵法です。

(無題) 削除/引用 No.3882-6 - 2011/01/27 (木) 09:29:57 - ut > > 陽性細胞をフローサイトメーターで見れたらと思いますが、浮遊細胞を使用するものなので、スライドに接着した細胞の計測は無理なんですよね？ > 接着細胞でもトリプシンで剥がして、固定後、染色して細胞周期をFACS解析できます。というか多くの論文で行っていると思います。

(無題) 削除/引用 No.3882-5 - 2011/01/27 (木) 06:33:44 - ab 追加ですが、ImageJで計測する場合は、視野は400倍でもいいですが、もっと小さい倍率でも計測は可能ですので（密度によりけり）、視野による違いは400倍で見る場合ほど大きくならないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3882-4 - 2011/01/27 (木) 06:17:14 - ab 細胞密度80%ということですが、BrdUもHiston H3も核なので、細胞が凝集していなければ下記の方法で簡単にできます。Thresholdとか全ての設定を統一すると差もでます。 http://www.frontier.kyoto-u.ac.jp/rc03/about_lab/colony_count.html 染色（特にDAPI）にムラがあったり、細胞が凝集してうまくThresholdを決められない場合は難しいです。 その場合は、400倍であれば手で数えてました（テクニシャンが）。時間かかりますけど。 1つのwellで陽性細胞数に偏りがあるのは、masaさんの指摘しているように、細胞密度がばらついていたり、薬剤刺激をする時に濃い薬剤液をいれたりして薬剤の局所濃度が異なることに起因する可能性があります。 その辺は大丈夫でしょうか？ あるいは、無作為に視野を選んで複数回の実験の結果を解析して、視野による違いに関係なく有為差がでればよいような気もします。

(無題) 削除/引用 No.3882-3 - 2011/01/26 (水) 22:22:25 - Actias 「シグマ 細胞周期 フローサイトメーター」で検索し、こんなんありました。イメージングを宣伝していますけど、手順は参考になります。 http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/cellular_science/pdf/335712.pdf または http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/cellular_science/inca_an_335712.asp

(無題) 削除/引用 No.3882-2 - 2011/01/26 (水) 19:34:32 - masa 80%コンフルという条件ですと、細胞同士がかなり密になっているので薬剤添加の有無に関わらず細胞周期の進行が阻害されていると感じます。その条件には何か理由がおありでしょうか？ BrdUや、p-Histon3の陽性細胞をカウントする際には、視野にいる全細胞数をDAPI等の染色でカウントし、陽性細胞数を％で割り出すと思いますがそれは実施されていますでしょうか？もしそれでも視野ごとにばらつきが生じるのであれば、撒種する際の細胞が均一でない可能性がありますので手技の向上を目指しましょう。 付着細胞でもTE処理後に染色を行えばフローサイトメトリーでの測定は可能です。BrdUや、p-Histon3染色を行わずに、PI染色で大まかな細胞周期の変化を見ることも可能です。 p-Histon3でしたら、免疫染色ではなくウエスタンブロッティングでシグナルを評価する方法もあると思います。

接着細胞の細胞数計測について 削除/引用 No.3882-1 - 2011/01/26 (水) 15:31:23 - nao この度はお世話になります。研究1年目の者です。 　現在、3種類の細胞を、16well チャンバースライドに播いて、80％コンフルになったところで、serum starvationして24h後に薬剤を投与。更に24h incubateした後に、抗BrdU抗体、抗p-Histon3抗体を用いて免染を行い、細胞周期を見ております。 抗BrdU抗体、抗p-Histon3抗体陽性細胞数を測定し、細胞間での陽性細胞数の差や、薬剤の濃度の違いによる陽性細胞数の差を出したいと思っております。しかし、うまく細胞数を計測し、比較できるようにする方法が浮びません。 �@imageJで細胞計測をやってみたのですが、使い方が手探り状態で、今の所細胞数が正確に測定できる気がしません。 �A蛍光顕微鏡下目視で400倍の視野で何視野か数え、平均を出そうとも思いましたが、検体が多く、労力がかなり大きそうです。更に、同じwellの中でも、細胞増殖の激しいところとそうでないところがあり、計測する視野を選び難いです(同じwellでも見ているところで、そのエリアの増殖の程度によって、陽性細胞数に偏りがあります。) 陽性細胞をフローサイトメーターで見れたらと思いますが、浮遊細胞を使用するものなので、スライドに接着した細胞の計測は無理なんですよね？ うまく陽性細胞数を比較できるような手法はありませんでしょうか？どうかご教示下さい。何卒宜しく御願い申し上げます。

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