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(無題) 削除/引用 No.3887-12 - 2011/01/28 (金) 22:48:55 - yyy 参考までに。 FLAGやMycタグ程度の長さなら、自分だったらsite-directed mutagenesisでつくってしまいます。 　 それが出来ない理由があるかも知れませんが。

(無題) 削除/引用 No.3887-11 - 2011/01/28 (金) 21:45:23 - Actias そうそう、ベクターの脱リン酸化が必要です。 オリゴにリン酸化を施すのがいいか（ベクターは脱リン酸化） オリゴはリン酸化しないでベクターの脱リン酸化もしないのか、 ラボにある試薬とか流儀とかで考えてください。 うちは、いまだにオリゴにRI末端ラベルする環境なので、酵素も ATPも手近にあるし、なんとなく脱リン酸化しないベクターでは うまくいってない気がするので、ベクターの脱リン酸化は習慣的に やっています。 ということで、No.3887-6 のTS さんご指摘のように、書き忘れました。 ところで、 http://dna.brc.riken.jp/ja/RDB5956ja.html pcDNA3にこだわらないなら、こういうのも有ります。

(無題) 削除/引用 No.3887-10 - 2011/01/28 (金) 11:19:46 - 774 みなさん同じようなことを考えるんですね。 僕もpcDNA3.1+にFLAG,MYCを入れたことがあります。 その時はNheI-Hind3でやりましたが、後でラボの先輩から”突出末端ができるようにオリゴを設計すりゃいいのに。”と言われて目から鱗が落ちる気分でした。 インサートは制限酵素処理して繋ぐものだと思いこんでしまってたので。 それ以降、shRNA発現ベクター作成などはその方法で上手くいってます。 オリゴを注文してる間にベクターを切断しておいて、到着し次第ライゲーションすれば時間効率もかなりいいですよ。 ただ、インサートはかなり薄めないといけません。 希釈をサボったら全然とれなかったです。

(無題) 削除/引用 No.3887-9 - 2011/01/28 (金) 09:37:14 - ばいや 私ならオリゴにリン酸基をつけないです。 つまりTSさんのやり方で行います。 高いでしょ。

後出しですみません 削除/引用 No.3887-8 - 2011/01/28 (金) 08:09:12 - Boston-Pullman 実は私も同じベクターでFLAGを入れる予定です。 私はある遺伝子（トピ主さんの場合は短めの適当な遺伝子でよいかと思います）を以下のプライマーを使ってPCRします。 Fwd: 5' GCC-HindIII-FLAG sequence-BamHI-GeneX 3' Rev: 5' GCC-EcoRI-GeneX PCR産物をHidIII/EcoRIで切断し、直接pcDNA3(+)へ組み込みます。FLAG下流の遺伝子はBamHI以下の制限酵素を利用して、目的の遺伝子に入れ替えればよいだけです。 オリゴのアニーリングは苦労した経験があったので、この方法をとっています。オリゴだとPCRでないとインサートの確認が困難ですし。 フォワードプライマーは長くなってしまったので、念のために精製度の高いPAGEグレードを注文しています（長すぎてHPLCグレードは発注できませんでした）。リバースは手元に届いているのですが、、、。

大変勉強になりました 削除/引用 No.3887-7 - 2011/01/28 (金) 03:14:56 - アキ オリゴの設計の際に、あらかじめ突出末端にしておけば制限酵素処理が必要なくなるわけですか。 気がつきませんでした、大変有益なご意見ありがとうございました。 両端を同じ制限酵素サイトで設計した場合、セルフライゲーションを防ぐための脱リン酸化処理が必要なのですね。その際は、オリゴの方にリン酸化処理をしておかねばならないのですね。丁寧にご説明いただき大変感謝いたします。 実際は、FLAGタグとMYCタグをpcDNA3に入れてみようと思っているので、オリゴは短いものになります。エタ沈も必要なさそうなので安心しました。 皆様たくさんのアドバイスありがとうございました。 大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.3887-6 - 2011/01/28 (金) 00:38:18 - TS Actiasさん： ＞ただし、オリゴの末端リン酸化処理は必要です。 誤解があるといけませんので一応補足です。 オリゴの末端リン酸化処理が必要なのは、セルフライゲーション防止のためにベクター側を脱リン酸化した時です。 しないならベクター側にリン酸基がありますから、オリゴ側にはリン酸基を付ける必要はありませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3887-5 - 2011/01/27 (木) 23:16:03 - Actias オリゴ設計時にベクターの制限酵素サイトにあわせた突出末端にしておくことについて。 １．オリゴの制限酵素処理が必要なくなる。 については皆さん仰ってますとおり。 ただし、オリゴの末端リン酸化処理は必要です。 両ストランドの１本鎖を混ぜてリン酸化酵素反応をし、そのまま熱処理してアニーリングすれば、リン酸化酵素の熱失活も同時にできます。 ２．ベクターとのライゲーション後に切れなくなる配列を選んでおく。 そうすると、使えるベクターのサイトが減ることが無いです。 たとえば、ベクターもオリゴもBamHI で切ってから入れてしまうと、出来上がったベクターでBamHIは使えません。オリゴがBamHIで切り出されてしまいますから。 でも、ベクターをBamHIで切り、オリゴの設計を、片側がBamHIが復活するように、もう片方はつぶれるようにしておくと、入れたオリゴが切り出されることが無いのでBamHIが使えます。オリゴの下流に入れれば、インサートを入れるときに使えますし、上流に入れればタグ付きでインサートを切り出すことができます（タグ配列の下流に目的インサートを入れると想定)。 もちろん、わざとオリゴの両側ともBamHIサイトがつぶれる設計もありです。

(無題) 削除/引用 No.3887-4 - 2011/01/27 (木) 10:28:30 - ~ 中身はタグの配列ではありませんが、似たような操作はしていました。 制限酵素用のMバッファーをx1の濃度でつかって、100度にしたウォーターバスに放り込んで、蓋をして翌日まで放っておいていました。 （どこかの論文で見つけたアニーリング用バッファーを使って、サーマルサイクラーで温度を下げている人もいましたが） 気になるのは、なぜオリゴまで制限酵素処理するような設計にしているのでしょうか？ ベクター側に用いる制限酵素の末端に合うように両オリゴの末端をはみ出させておけば、別に酵素処理はいらないでしょう。 >なにか特別な精製法のものを注文すべきでしょうか？ メーカーと長さ次第だと思いますが、80bp位を入れるときでも簡易カラム精製のものを使っていました。 貴方が入れようとしているタグが何か分かりませんが、もっと長い配列であれば、より高い精製度のものを用い、合成ミスで長さが違うものなどを除いておいたほうが効率がいいかもしれません。 >制限酵素処理後の２本鎖オリゴは、エタ沈等で精製してからライゲーション反応を行うのでしょうか？ アニーリングした溶液をそのままライゲーションに用いていました。短いので、エタ沈する気は起きませんでした。 制限酵素処理する必要があるのでであれば、少なくとも酵素の失活のために何かする必要がありますね。

(無題) 削除/引用 No.3887-3 - 2011/01/27 (木) 10:27:32 - TS アニールしてライげーションするのですから、最初からCohesive endになるようにオリゴを注文すると楽だし、安いです。ステップ３を飛ばせます。 特にエタ沈とかも必要ないです。ゲル抽出を咬ませてもいいですが。 いろんなメーカーから、Vector based siRNAのプラスミドが発売されていますが、きっとそのマニュアルが参考になりますよ。たとえばこんなの。 http://www.genscript.com/tech_guide/tm0169.pdf インサートの長さはどの程度なんでしょう？ 少なくとも70 bpくらいまでなら、通常のＰＣＲプライマーと同じグレードでうまくいくと思います（高純度の方がより良いのは確かですが）。あんまり長いのはメーカー側も高グレードでないと作ってくれないですね、きっと。

(無題) 削除/引用 No.3887-2 - 2011/01/27 (木) 10:21:56 - あべちゃん >[Re:1] アキさんは書きました : > ベクターのマルチクローニングサイトにタグを挿入して、タグつきベクターを作りたいと思います。 > １　制限酵素サイトつきのタグ配列のオリゴを注文。 > ２　オリゴのアニール。 > ３　ベクターとオリゴの制限酵素処理。 > ４　ライゲーション。 オリゴ設計時にコヒーシブ部分を突出させればオリゴを制限酵素処理する必要ないです。 > また、制限酵素処理後の２本鎖オリゴは、エタ沈等で精製してからライゲーション反応を行うのでしょうか？ 高濃度でハイブリさせて、生理的塩濃度のバッファーで適度に希釈するだけでいいです。

タグつきベクターを作製する 削除/引用 No.3887-1 - 2011/01/27 (木) 10:10:59 - アキ ベクターのマルチクローニングサイトにタグを挿入して、タグつきベクターを作りたいと思います。 以下の流れで計画してみましたが、どなたかご経験のある方がいらっしゃいましたらご意見をいただければうれしいです。 １　制限酵素サイトつきのタグ配列のオリゴを注文。 ２　オリゴのアニール。 ３　ベクターとオリゴの制限酵素処理。 ４　ライゲーション。 オリゴはPCR用のプライマーと同じ通常のものを使おうと思いますが、なにか特別な精製法のものを注文すべきでしょうか？ また、制限酵素処理後の２本鎖オリゴは、エタ沈等で精製してからライゲーション反応を行うのでしょうか？ 以上よろしくお願いいたします。

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