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(無題) 削除/引用 No.3889-22 - 2011/02/05 (土) 14:24:20 - aji 既に310さんが提案していることですが、アダプターに二つのプライマーを組み込むのが有効だと思いますが、変法として、今のcDNAに対してアダプターの5'側に伸ばした長いプライマーと伸ばした分だけのプライマーを混合したプライマーと縮重プライマーでPCRしたのち、最初のアダプターを使えばNestedになります。 これはClontechのSMARTRACEのまねです。是非、SMARTRACEの説明書を読んでください。参考になると思います。 私は普通のRACEしかやったことはありませんが、アダプタのみの増幅産物を減らすにはプライマー濃度5分の1から10分の1に下げるのがかなり有効でした。

(無題) 削除/引用 No.3889-21 - 2011/01/30 (日) 17:31:19 - AP RACEを成功させるにはいろいろと障壁があるので（標的RNAの豊富さ・精製度・安定性、逆転写の効率、アダプタープライマーとアニーリング温度などのバランスのよいGene-specific primerの設計などなど）、degenerated primerでやるのは難度が高いと思います。 ゲノムPCRでdegenerated primer周辺のエクソン配列を取得し、その正規の配列からユニークなGene-specific primerを設計してRACEに取り掛かるのがよいかと思います。 ゲノムDNAを適当な制限酵素で切断して、それにアダプターをligationして、アダプター-Gene-specific primer間でPCRする、adaptor-ligation-mediated PCRあるいはvectorette PCRとよばれる方法が役に立つでしょう。市販のシステムもありますし、自分の実験系に合わせたアダプターを自作するのもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3889-20 - 2011/01/30 (日) 16:19:20 - DNA+boy ンンノさん＞ やはり縮重プライマーでのRT-PCRが良さそうですね。 もう一度検討してみます。 Boston-Pullman さん＞ expression cloning という手法を始めて聞きました。 調べて、今回の研究で利用できそうか（ラボの予算も含めて）検討してみます。バックアッププランも考えます。 Actiasさん＞ 勉強になります。確かに、全ての可能性を考える事を忘れていました。 ありえないと思っても考えてみることの大切さを学びました。 真核生物です。 個人が特定されそうで詳しくは言えないのですが刺胞動物門の生物です。 何とか二箇所のアミノ酸配列が得られないか考えてみます。 Pumpkinさん＞ ラボで飼育するのは困難です。 また、生物が居る場所および季節も限定されており大量サンプルを得るのは不可能といって良い状況です。 今後はプライマーの再設計および皆様からご指摘があるようにＢ案を考えたいと思います。 何とか良い結果が得られるように頑張りたいと思います。 ここで質問させていただいた事で、私たちのラボで行っている実験の妥当性や状況が良く分かりました。ありがとうございます。 また、何かご指摘やご提案などありましたら書き込みをよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3889-19 - 2011/01/30 (日) 01:18:49 - Pumpkin >無謀とも思える方法を用いて解析を行っています。 私は無謀だとは思っていませんよ。実際に、それしか手がなく、クローニングに成功した遺伝子もいくつかあります。私が書いたのは「厳しい」という現実であって、非難しているわけではありません。 厳しいという現実からンンノ様のように縮重プライマー同士のPCRを薦めようとおもったのですが、45bpではいかんともしがたいですね。 mRNAの存在ですが、野生生物っていうのは培養（？）とかできるのですか？生きている個体ホールから蛋白が取れているのであれば、それからmRNAもとれると思います。とれない場合もなきにしもですが、その時はかなりレアな状態でしょうから残念としかいえません。いずれにせよBoston-Pullman様が言うように、B案を考えるのはストラテジー上重要かとおもいます。 ただ、私個人の私見ですが（書いていることは全て私見なんですが）、縮重PCRはプライマーの出来が全てで（それを活かす条件もプライマーの出来に規定される）、色々とできる限り試してみればいいと思います。アニーリング温度が40℃でスメアーがひどい中にかろうじて一本のバンドがでたものをきりとり、2nd PCRでクローニングして当たりをみつけるなんていうのは日常茶飯事です。ただし、RACEだという状況は、さらに困難ですが。

(無題) 削除/引用 No.3889-18 - 2011/01/29 (土) 21:57:51 - Actias ＞polyAが存在しないmRNAもあるのでしょうか？ ヒストンは（と一般化した言い方はよくないかもしれないが）そうです。 また、原核生物もそうです。 ただ、深い意味があって書いたのではなく、そういうこともあっても実験は失敗するな、と思ったので書いたまでです。 ＞タンパク質が有ってもmRNAが存在していない 作った細胞と持っている細胞が異なればそうなります。これも特殊な例ですが、ハエの卵では機能分子としての蛋白質が貯蓄されて卵が産み落とされます。また、的確な例が思いつかないのだけど、ヒトのホルモンなどでも、作った細胞と貯蔵する細胞（組織）が異なることがあります。 実験材料が潤沢ではないのはたいへんですね。 その野生生物って、真核生物ですよね？ 分類上はどういう生き物ですか？ できることなら、アミノ酸配列は一つじゃなく、もっと欲しい。

(無題) 削除/引用 No.3889-17 - 2011/01/29 (土) 20:35:46 - Boston-Pullman ようやく困っておられる状況が分かりました。 degenerated PCR は経験がある人でも困難です。以前、所属していたラボでは年単位でした。 配列がわかっている１５残基の合成ペプチドで抗体を作って、expression cloning するのも手です。いずれ抗体は必要でしょうし。 なのかバックアッププランを考えた方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3889-16 - 2011/01/29 (土) 18:12:18 - ンンノ タンパク質のSDS-PAGEをしてるでしょうから、おおよその分子量の検討は つくと思いますが．．． 仮に５０ｋDaくらいのタンパク質だったら、おおよそ５００アミノ酸くらい で、ｍRNAのコード領域は１５００塩基なので、N末端配列からプライマー を設計してもmRNAの3'-非翻訳領域が長かったら、目的のクローンはとれて るか微妙なところですね。 トリプシン消化したペプチド断片の配列を何箇所か決めて、RACEではなくて 縮重プライマー同士でPCRをやるほうが少し易しい気がします。

(無題) 削除/引用 No.3889-15 - 2011/01/29 (土) 17:40:31 - DNA+boy Actiasさん＞ 詳しくありがとうございます。 Degenerate プライマー=縮重プライマーですので、1,2は行っていると思います。 分かっているアミノ酸配列は15残基で、一箇所のみです。 3,に関しても、アミノ酸配列が明らかになっているのは一箇所であり15残基という事から、挟み込んでのPCRも困難であると思います。 > ４．遺伝子（ゲノム）があって蛋白質があってもmRNA が無いことはあります タンパク質が合ってもmRNAが存在していないということは恥ずかしなが初めて聞きました。詳しく教えていただきたいです。 > ５．その生物のイントロンは長いことが予想されるのでしょうか？無謀かもしれませんが、２と３がだめでも、Degenerate プライマーからゲノムPCRができないでしょうか？ > 現在、ラボにゲノムPCRの習慣が無いので検討してみます。 > ６．４と関連しますが、poly(A) はあるのですか？3'RACEにこだわるならということの話ですが。 mRNAにはpolyAが普遍的に存在していると思っていました。 polyAが存在しないmRNAもあるのでしょうか？ > ７．野生生物由来ということですが、材料となるgenome DNAとかRNA は潤沢に手に入るのでしょうか？ 希少サンプルであり沢山手に入れることは困難です。 また、現在ラボにも少量しかありません。 > ８．「近縁種に相同性の高い生物はいません」近縁種は存在するのですね。ゲノム配列とかESTはDNAデータバンクに登録されていませんか？近縁種に限らず、相同性の高いアミノ酸配列をコードする塩基配列はデータバンクに登録されていませんか？tblastnで、何かしらは出てきそうな気がするのだけど。 相同性のある配列はblastで見つかっていますので、そちらに関して詳しく調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.3889-14 - 2011/01/29 (土) 16:47:11 - Actias １．プロテインシーケンサーにかけたくらいだから、蛋白質コード部分の塩基配列長は推定できますね。よほど変な蛋白質でない限りアミノ酸残基数は推定できます。どのくらいですか？ ２．得られたアミノ酸配列は複数でしょうか？相当する塩基配列は分かってますか？ そんなに長くないと思いますが、それぞれのアミノ酸配列に対応する塩基配列は得ていますか？Degenerate プライマーを設計して、PCR産物を得て配列情報を得ればいいと思います。 ３．上記２の配列がでれば、アミノ酸配列ごとにプライマーを設計して全部の組み合わせでPCRをやれば？ でてきたアミノ酸配列が遺伝子上でどの順番でコードされているかは不明でも、cDNA上に貼り付けていった場合、推定した塩基配列長より長いことは無いはず。たとえばアミノ酸配列Aの5'プライマーとBの3'プライマーの組み合わせ、あるいはその逆の組み合わせででてくるPCR産物はcDNAに推定したコード領域とおなじか短いはずです。 ４．遺伝子（ゲノム）があって蛋白質があってもmRNA が無いことはあります。「無いものをがんばってとろうとしてませんか」という意味で、発現してますかと質問しました。２と３ができていれば、「有るから獲る」といえます。 ５．その生物のイントロンは長いことが予想されるのでしょうか？無謀かもしれませんが、２と３がだめでも、Degenerate プライマーからゲノムPCRができないでしょうか？ ６．４と関連しますが、poly(A) はあるのですか？3'RACEにこだわるならということの話ですが。 ７．野生生物由来ということですが、材料となるgenome DNAとかRNA は潤沢に手に入るのでしょうか？ ８．「近縁種に相同性の高い生物はいません」近縁種は存在するのですね。ゲノム配列とかESTはDNAデータバンクに登録されていませんか？近縁種に限らず、相同性の高いアミノ酸配列をコードする塩基配列はデータバンクに登録されていませんか？tblastnで、何かしらは出てきそうな気がするのだけど。 以上、オリゴ合成の資金とかラボの得意手技とかを考慮せず、手間のかかる方法を提案してみました。

(無題) 削除/引用 No.3889-13 - 2011/01/29 (土) 14:59:39 - DNA+boy 310さん＞ ありがとうございます。 教えていただいた方法を検討してみたいと思います。 Pumpkinさん＞ 揺らぎはありません。 私の所属しているラボでは同様の方法で、縮重プライマーで3'RACEを行いアミノ酸配列の解析に何度か成功しているので無謀とも思える方法を用いて解析を行っています。 今回扱っているタンパク質に関して明らかになっているアミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行いました。 しかし、近縁種に相同性の高い配列を持つ生物はいませんでした。 何とかgene specificプライマーを作成したいと考えているのですが、ご指摘の通り解析されているアミノ酸残基が少ないので縮重プライマーで少しでも良いので塩基配列を解析しようと試みている次第です。 ンンノさん＞ 目的のタンパク質は、カラム精製で単離したのちプロテインシーケンサーで解析を行い部分アミノ酸配列を明らかにしたものです。 なので、遺伝子上ではどのようにコードされているのかは分からず、またサイズも不明です。 アダプタープライマーで増幅したもののサイズは500bpから1500bpまで様々です。 Actiasさん＞ 説明不足で申し訳ありません。 今回言っているcDNAとは、1st strand cDNAで、mRNAに相補的なDNAです。 mRNAのpolyA領域に結合するプライマーと逆転写酵素で合成したDNAです。 ここでもちいたプライマーはpolyA領域の下流にmRNAとは結合しないアダプター配列を持っており、これが存在していることで合成したcDNAのpolyA領域の下流に人為的な配列であるアダプター配列を付加させます。 AUAPとは人為的に付加させたアダプター配列に特異的に結合するプライマーであり、アミノ酸配列を基に作成した縮重プライマーとAUAPを用いてPCRを行うことで塩基配列解析を行うというものです。 現在解析を行っているタンパク質は、野生に生息している生物から取った新規物質であり、明らかになっている情報がアミノ酸配列だけなので3'RACEを用いて塩基配列を試みています。 また、実際にタンパク質への翻訳が行われていることから遺伝子は確実に存在していると思います。RNAも生物全体から得ているので、問題ないと考えています。 あさん＞ 新規の物質なので登録はありません。 説明が不足していて申し訳ありません。 現在、私が取り組んでいる物質は野生生物から得られた新規タンパク質のアミノ酸配列を基に演繹一時アミノ酸配列を明らかにしようという研究です。 そこで、得られたアミノ酸配列を基にミックス塩基を含んだ縮重プライマーを3種類設計して3'RACEを試みました。用いたRNAは生物全体から抽出したものです。 しかし、縮重プライマーを用いている関係で目的の塩基配列を得ることが出来ず困っているという状況です。目的の塩基配列が得られないという理由は、得られた塩基配列をDNAシーケンス解析しても縮重プライマーに相当する配列が含まれていないからです。 ご教授よろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.3889-12 - 2011/01/29 (土) 12:28:59 - あ 質問には対応しませんが、プロテインシーケンサーで得られたアミノ酸部分配列のホモロジーサーチから、cDNAの配列はわからないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3889-11 - 2011/01/29 (土) 11:04:34 - Actias 返事しようかどうか迷ったのですが、書くことにしました。 トピ主さんは、回答者からの質問へ応えるときに、論理的展開も実験操作も含めて書いた方が良いと思います。 標的遺伝子の名称や配列が伏せられたままで議論するには、大事です。 RACEはRapid Amplification of cDNA endの略で、ネットでは 3´RACEは、mRNAの既知配列とポリ（A）配列の間を一気にPCRで増幅する方法である という記述を見つけました。 それで、僕の1番目の質問になったわけです、合成したcDNAはどの実験操作時点のことを考えているのかと。 その答えが 「3'RACEで合成するcDNAは一本鎖以外ないと認識しているのですが」 です。でも、そう思ったプロセスが記述されないと、論理展開も実験操作のプロセスも共有できません。 縮重プライマーとかAUAPとか、具体的な実験操作の絵として頭に思い浮かべることができず、質問への答えをいただきましたが、分からないままです。 僕が学生だけでなく給料をもらっている研究者であっても、「うまくいかない」という相談を受けたときに、必ず「うまくいくの？」と聞き返します。 原理的にはこうである、自分の材料ではこういう配列だから原理が応用できる、ということが成立しないと、成功しません。 そもそもの話ですが、 なぜ3'RACE をするの？他の方法はないの？ 標的は手持ちのRNAの中にあるの？つまり遺伝子は発現しているの？

(無題) 削除/引用 No.3889-10 - 2011/01/29 (土) 02:09:49 - ンンノ 入門編としては技術的にかなりレベルの高い実験だと思います。 増幅されるサイズは見当点いてるんでしょうか。 mRNAには３’非翻訳領域があるので、３’RACEをすると増えてくる断片のサイズは タンパク質のサイズ×３倍の塩基数よりも必ず大きくなりますが。 アダプタープライマー同士で増えたもののサイズはどれくらいですか。

(無題) 削除/引用 No.3889-9 - 2011/01/28 (金) 18:16:22 - Pumpkin Actiasさんの言うように、僕も少し飲み込めないんですが、 興味のある蛋白質のぺプタイド配列を決めて、それから縮重プライマーを用いてこれとアダプタ付きOligo dT（AUAP?)でPCRやっているんですよね。で、問題は縮重プライマーでRACEをやっている点です。 そもそも縮重プライマーでRACEというのは厳しいので（縮重プライマーもAUAPも遺伝子特異性からいったら、低い） >AUAPがFwプライマーとして働いてしまう場合 これは、縮重プライマーのデザインが悪いの一言に尽きます。縮重プライマーを用いたPCRでは特異性を低くするためにアニーリング温度を下げているのではないかと思いますが、縮重プライマーがアニールするよりもAUAPの方がアニールしやすければ、そのような結果もありえます。縮重プライマー1つあたり、何種類のプライマーが存在するような計算でしょうか。なるべく少なくなるように設計していると思いますが。また、縮重プライマーの3'端はコドンの揺らぎはありませんよね？ できれば部分塩基配列だけ決めて、この配列を基に作った遺伝子特異的プライマー(GSP)とAUAPで3'RACEするのが得策です。しかしながら、ペプチドは数アミノ酸しかきまっておらず、それらを縮重プライマー同士でPCRできる長さはないんですよね。また、近縁種でそのぺプタイドとホモロジーのある遺伝子は登録されていませんか？されていれば、それらのアライメントを取って、保存性が高い領域を3'末端にもってくるとかは基本的にやられていることです。

(無題) 削除/引用 No.3889-8 - 2011/01/28 (金) 14:27:02 - 310 >2.3に関して質問があります。 >二種類の新しいAPということですが、現在使用しているアダプター配列から >二種類のAPを作成すればよいのでしょうか？ >もしくは、polyT以降のアダプター配列を新たに設計するという事でしょう >か？ APの長さとTm値によります。新たに設計できれば、そちらがいいのですが私も設計方法を探しているくらいなので、適切な設計に関するアドバイスは、他の方にお願いします。他種の配列で、自分の生物にblastでヒットしないのを選んできて、primer-blastに対応した生物種であれば、増幅領域に適当な配列をねじ込んで、primer-blastでチェックしてみてください。RTの配列はそのままにしたいのなら、5塩基ほどずらして２つのプライマーを作るのも手です。3’の5塩基までは特異性に大きな影響を持つからです。

(無題) 削除/引用 No.3889-7 - 2011/01/28 (金) 13:00:06 - DNA+boy 310さん＞ 1.に関しては、現在3種類のミックスプライマーを用いてPCRを行っています。 記述を忘れてしまいました。 2.3に関して質問があります。 二種類の新しいAPということですが、現在使用しているアダプター配列から二種類のAPを作成すればよいのでしょうか？ もしくは、polyT以降のアダプター配列を新たに設計するという事でしょうか？ 質問が多くなってしまい、申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.3889-6 - 2011/01/28 (金) 12:48:36 - DNA+boy Actiasさん＞ ＞ total RNAを3'RACE法でcDNAを合成し 3'RACEで合成するcDNAは一本鎖以外ないと認識しているのですが ＞ 縮重プライマー 下記のように既知アミノ酸配列から設計したものです ＞ AUAP 310さんが書いてくださったようにAPの一種です ＞ 得たPCR産物を用いてDNAシーケンス T7で、精製はExoSAPです ＞ AUAPだけで増幅した配列 通常、増幅しないはずなのに増幅したので質問しています ＞ AUAPの配列-未知配列-poly A 下記のようにDNAシーケンスの結果からです ＞ AUAPがFwプライマーとして働いてしまう場合 下記のようにDNAシーケンスの結果からです

(無題) 削除/引用 No.3889-4 - 2011/01/28 (金) 06:27:11 - 310 3'RACEを行っているようなので、逆転写時にpolyA+アダプタープライマーの配列をプライマーとして用いているのでしょう。AUAPはpolyAに対するPolyU(T?)の後にアダプターが入っている。縮重primerはdegenerate primer,アミノ酸配列から作った混合塩基配列(ミックス)のプライマーでしょう。 一般的にミックスプライマーを用いたPCRはアニーリングをあまり厳密にできないので、非特異的なアニーリングが起きがちです。アダプタープライマーのみで増幅が起きてしまうのもそのためでしょう。 わたしであれば、 1.ミックスプライマーを複数位置で作成する。 2.アダプタープライマー(AP)のTmを低め（配列短く and/or GC比が高くない）にして低アニーリング温度でも非特異増幅をおきにくい状態にする。 3.2種類のAPをpolyTプライマー以降に組み込む RNA量が数十グラム以上あれば、RT後にエタ沈、カラムなどで、RTプライマーを除去した方が、より安全でしょう。 1-3をした上で外側同士のプライマーで30サイクルのPCR、次に内側プライマーを使い20サイクルのNested PCRを行います。この際fidelityが高い(正確なDNA合成をする）ポリメラーゼを選ぶべきだと思います。大体の分子量が分かっている場合は最初のサイクルの後、アガロース泳動とゲル切り出しで、目的産物付近のみのDNAを回収して2回目のPCRの鋳型に使っても良いかと思います。 違っていたり分からないことがあればご指摘ください。

(無題) 削除/引用 No.3889-3 - 2011/01/27 (木) 22:56:42 - Actias どういう操作をしたのかさっぱり分からない。 ＞ total RNAを3'RACE法でcDNAを合成し で、できたものは何？ １本鎖のcDNA？（RNAの相補になるDNA？） すでに2本鎖？ ＞ 縮重プライマー 何に張り付くプライマー？場所と向き？ ＞ AUAP 何かの略号？ ＞ 得たPCR産物を用いてDNAシーケンス シーケンスプライマーは何？ PCR産物の精製方法は？ ＞ AUAPだけで増幅した配列 何？ 本来、AUAPだけで増幅できるの？ ＞ AUAPの配列-未知配列-poly A これが生成したと想像する根拠は？ ＞ AUAPがFwプライマーとして働いてしまう場合 この場合であると想像した根拠は？

誤植です 削除/引用 No.3889-2 - 2011/01/27 (木) 16:18:36 - DNA+boy ×遺伝子十毛権→○遺伝子実験

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