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ありがとうございます。 削除/引用 No.3927-14 - 2011/02/05 (土) 16:04:14 - aaa ガラスボトムデッシュを使用するのは、倒立顕微鏡を使用したいからです。 しかし、普通の培養シャーレを用いて、同様にドラッグを添加し、 観察を行いましたが、インキュベート24ｈ(いつもは、5分です）経過しても細胞は浮いてきませんでした。 PLLコートの洗い回数が悪かったのかなと思います。 もう一度、5回洗浄して試してみます。 だめなら、コーラーゲン�Tコートを試してみようと思います。 みなさん、丁寧に回答して頂き、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3927-13 - 2011/02/03 (木) 20:23:03 - w poly-lysの毒性は、塩基性のペプチドが細胞膜に障害を与えると思っています。 コートされた分子は通常の条件ではほとんど剥がれないものだと思っています。 ですから、コートされなかった分子を除去すると、ポリリジンはガラス鏡面にだけ存在し、細胞膜がそこに吸着して、細胞を接着させるのだと思います。毒性を発揮できるのは、固相化されていない遊離のポリリジンだけだと思っていますし、紹介したページも同じような考え方だと思います。固相に吸着させた分子が剥がれないのは、ELISAでも同じことで、もしもコートした分子が剥がれるのであれば、ELISAは成立しません。

(無題) 削除/引用 No.3927-12 - 2011/02/03 (木) 15:08:05 - Boston-Pullman ガラスボトムディッシュを使っているには理由があるのでしょうか？私もMDAを培養していますが、培養用プラスティックディッシュにはコーティング剤なしで接着します。血清を除くと浮き易くなりますが、生きています。

(無題) 削除/引用 No.3927-11 - 2011/02/03 (木) 12:05:51 - こーてぃんぐ 失礼。 お使いなのはPLLですね。 PDL、PLLで大差はないと認識していますが、、、

(無題) 削除/引用 No.3927-10 - 2011/02/03 (木) 12:02:08 - こーてぃんぐ 主に初代培養神経細胞（マウス）や初代培養繊維芽細胞（ヒト）を扱っている人間なので質問者様の細胞に関して何ら知識を持ち合わせておりませんが、思い切ってコーティング無しはいかがでしょうか？ 神経細胞はPEIやPDLコーティング無しでは殆どガラスに細胞はくっつきませんが、少なくとも私の扱っている繊維芽細胞はPDLでコートすると接着がすこぶる悪くなります。 他の方が仰っている様に細胞毎に適した（というか接着細胞がちゃんと接着する）条件は異なりますので。 質問者様の場合、薬剤処理すると剥がれるとの事なので、原因は異なるかも知れませんが、参考になれば。 因みにwashの回数は滅菌水で二回（35mmの場合、2ml X2）。 というかそもそもそのドラッグが悪さ？をしているのでは？ 極端、細胞接着を阻害すれば剥がれやすくなるだろうし。 勿論、コントロールとして薬剤を入れずに（or DMSO）で同様の処理をして細胞は浮いてこないのですよね？ 加えて、"インキュベートを行うとすぐに"とありますがどのくらいのスパンでしょうか？？ またPDLの濃度は？？

(無題) 削除/引用 No.3927-9 - 2011/02/03 (木) 11:28:35 - ats 失礼しました。ホウ酸は動物には毒性が低いようです。

(無題) 削除/引用 No.3927-8 - 2011/02/03 (木) 11:25:00 - ats ホウ酸も毒ですよ。ホウ酸団子があるくらいなので。ホウ酸bufferで希釈しているようなので、５回くらいリンスしたほうがよいでしょう。 また、poly-L-lysineは高価ですがPEIなら極安価です。神経細胞で使用している例もあります。

poly-l-lysineの細胞毒性について 削除/引用 No.3927-6 - 2011/02/02 (水) 23:48:58 - aaa ｗさん poly-l-lysine自体に細胞毒性があるのですね・・・ 勉強になりました。 しかし、コーティングした後、三日間培養したのですが ドラッグ添加するまでは、細胞は定着していました。 poly-l-lysine自体に細胞毒性があるなら、三日間のうちに はがれていかないのかなと思うのですが・・・。 素人考えで申し訳ないですが、お願いします。

(無題) 削除/引用 No.3927-5 - 2011/02/02 (水) 23:04:40 - w //mitchison.med.harvard.edu/protocols/gen1.html では、以下のように言っています。 Coat with polyamino acid. 1) Coat coverslips in bulk in 10-15ml 1mg/ml PLL (or 500ug/ml polyornithine), rocking or rotating for a minimum of 30 minutes in a 10 or 15cm tissue culture dish. 2) Save the polyamino acid (can reuse 3-4 times). 3) Wash the coverslips in dH2O, then ddH20 at least 5 changes in each (free polyaminoacid is cytotoxic). 4) Rinse coverslips in 100% ethanol and dry those to be used immediately on one end in an open tissue culture dish in a sterile incubator. 5) When dry, add cells. ＞変なものは入れていないはずですが・・・。 つまり、freeのpolyLysは、それ自体変なものなのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3927-4 - 2011/02/02 (水) 20:49:57 - aaa TSさん 丁寧な回答ありがとうございます。 poly-L-lysine 5mgをｍＱ水 1 mLで溶解し、0.45umのフィルターでろ過した後、0.015Mホウ酸buffer (pH8.4)で希釈しました。 ホウ酸bufferは、オートクレーブをかけたものを用いました。 変なものは入れていないはずですが・・・。 コラーゲンコートの方をとりあえず試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3927-3 - 2011/02/02 (水) 20:35:11 - TS 洗浄は、１回で良いんじゃないかなと思います。たくさん残したいのであればなおさら。Poly-L-lysineの溶媒に変な物を使用してないですよね。 また一概には言えませんが、一般的にはPoly-L-lysineよりCollagenの方が上等、かつ生体内のコンディションにに近いコーティングだと私は思います。細胞種による向き不向きはもちろんあるでしょうが。 試す価値は十分にありかと。

細胞の種類 削除/引用 No.3927-2 - 2011/02/02 (水) 20:09:53 - aaa 追加ですが、すみません。 使用している細胞の種類はMDA-MB-231です。 文献を見てみるとコラーゲン�Tにてコーティングされているカバーガラスを 用いてるものをみかけたので、そちらのほうが向いているのかなとも思います。 poly-L-lysineコーティングとコラーゲンコーティング、 どちらのほうがこの細胞に向いているのかも、合わせて返答いただければ、 うれしいです。

poly-L-lysineコーティングでの洗浄回数の影響 削除/引用 No.3927-1 - 2011/02/02 (水) 19:44:49 - aaa 現在、poly-L-lysineでコーティングしたガラスボトムディッシュを用いて、 細胞観察をおこなっています。 しかし、ドラッグ添加した後インキュベートを行うとすぐに細胞が 浮いてきてしまいます。 原因としてコーティング後の洗浄回数が疑われます。 私は、コーティング後、PBSにて洗浄を一回しか行っていません。 コーティングを行うのは、私の所属する研究室では初めてで、 教科書を参考にして行ったのですが、洗浄回数までは記載されていませんでした。 インターネットで調べたところ洗浄回数は三回以上が常識のようですが、 細胞の定着具合に影響を与えるのかどうか教えて頂けないでしょうか。 お願いします。

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