全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございます 削除/引用 No.3940-12 - 2011/02/08 (火) 15:44:40 - ひよっこ 皆さんありがとうございます。 ご指摘のように培養細胞をベンチ外で扱うことはできればやりたくないのですが、実験環境の都合により、ベンチ外の顕微鏡を用いています。（一応、ほかのラボの経験者の手法を参考にしています） できれば実験書によくあるようにシリンダー等を用いて無菌的に行いたいのですが。。。 ベンチ内で顕微鏡をのぞいて・・・という作業は今後も難しいので、限界希釈法が確実かなと思っているのですが、顕微鏡でコロニーの位置にマークできれば、ろ紙を用いた方法を試してみたいと思います。 ベンチ外の作業でもコンタミはほとんどしないというご意見もいただきましたので、再度、私の手法も見直してみたいと思います。 みなさんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3940-11 - 2011/02/07 (月) 19:34:09 - FACS EFGPなどの融合タンパク質の場合、 FACSで分取した後、希釈して増殖させ、またFACSで分取を繰り返すのはどうでしょうか？ 未発現細胞の割合も分かるかと思います。 もちろん、FACSは無菌的に。

(無題) 削除/引用 No.3940-10 - 2011/02/06 (日) 23:00:47 - C 私もシングルコロニーのピックアップが私の手では難しかったので、96well で段階希釈してシングルコロニー／wellをつくりそれをクローニングしました。コロニーが大きくなるまで立ち上がりに時間がかかったのでだいじょうぶかなあと心配でしたが、ある程度まで増えてくると後は普通のスピードで増殖してきました。２個とか３個とかのコロニーがあるwellは、コロニーがあまり大きくならないうちに、そこからさらに段階希釈してまいてシングルコロニー／wellをつくりました。十数個のクローンを得て、それぞれ発現レベルをウェスタンでチェックしました。だいたい同じ位の発現レベルでしたがいくつか発現のかなり低いもの、すごい高いものもありました。外来遺伝子の過剰発現に伴うアーティファクト介入の可能性を考慮して、発現レベルの違うをいくつか選んでそれぞれで実験結果を比較したほうがいいと先生にアドバイスされました。かなり無理なことをしているので、インターラクションや修飾、局在などの解析では特に慎重にということでした。

(無題) 削除/引用 No.3940-9 - 2011/02/05 (土) 09:45:48 - w >酵素学専門のラボで、自分を含め周りも細胞実験の初心者なので、 とのことですから、まずは古典的なクローニングシリンダか、やや新しい感じの「トリプシンろ紙」でやってみるのが良いと思います。 実際のところ、顕微鏡でコロニーをピックするのは、思いのほかコンタミしませんし、いずれの方法を採用するにしても、何でもない細胞でコロニーピックの練習程度をやっておくことは良い保険になります。それでコンタミするようなら、方法を代えるべきですね。 吸い込んだ細胞塊+培地10ul程度とチップの先端に雑菌が入っていなければ、コンタミするはずもないのです。とはいえ、ショートカットですから、古典的な方法をやったことのある人がやるのなら、結果を安心して考えることができますが、最初に指導者なしでひとりでチャレンジする方法としては適当でありません。 あなたのコンタミについては、もしかするとコロニーピックする前に起きていた可能性はないでしょうか？ 選択に用いた薬剤は、コロニーピックしたあと、除去したのではないでしょうか？ 除去して結構なのですが、除去することでコンタミしていたコーボ君が、息を吹き返した可能性を考えてしまいます。

(無題) 削除/引用 No.3940-8 - 2011/02/05 (土) 01:28:58 - Boston-Pullman 私は実験台にある実体顕微鏡を使ってコロニーをピックアップしています。 一度もコンタミしたことがありません。そもそも抗生物質が入っていますし。アンフォテリシンBを添加していれば、イーストのコンタミも抑えられると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3940-7 - 2011/02/04 (金) 22:47:08 - Eire こちらで以前紹介された方法ですが、 １）ろ紙を小さく切って（穴開け用パンチを使うと楽）オートクレーブ ２）１）を必要分トリプシン液に浸しておく。 ３）ピックアップするコロニーにシャーレの底からマーカーで印を付ける。 ４）細胞の培養シャーレから静かに培養液を除き、PBSで注意深く一回洗う。 ５）３）で付けた印を目安に、２）を1枚ずつ静かにのせる。 ６）室温、あるいはインキュベーターでしばらく静置。細胞の継代時と同じくらいの時間でよい。 ７）あらかじめ滅菌しておいたピンセットを使って、コロニーにのせたろ紙を1枚ずつピックアップして、選択培地の入った24-well プレートに移す（もちろん1ウェル辺りろ紙1枚）。 ８）プレートを培養し目的のクローンを得る。 細胞をぬぐったろ紙はプレートに入れっぱなしでも大丈夫です。細胞はプレートに移してから1，2日中にはウェルの底に接着して増え始めます。クローニングリング方よりも簡便で素早くできるのでおすすめです。ろ紙についてはこの目的用に切られ滅菌されたものも売られていますが（Sigma のカタログで見たことがあります）自作した方がはるかに安上がりです。

(無題) 削除/引用 No.3940-6 - 2011/02/04 (金) 18:08:17 - ~ >[Re:5] wさんは書きました : > クローニングシリンダーを使いなさいね。 東急ハンズで売ってた、金属パイプを短く切ったものが使いやすかったです。 10個単位で数百円程度なので、サイズを揃えるのも容易です。 経費で落ちるかどうかはラボによるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.3940-5 - 2011/02/04 (金) 18:01:05 - w クローニングシリンダーを使いなさいね。

(無題) 削除/引用 No.3940-4 - 2011/02/04 (金) 18:00:37 - ~ 数百個/dishだと、軟寒天培地上でコロニーをすくい取るやり方であればいけると思いますが、 コロニーリングを使うのであれば、20〜30個/10cm dish位がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3940-3 - 2011/02/04 (金) 17:58:48 - ぺにー ●顕微鏡を殺菌し、クリーンベンチ内に持ち込む。 うちはこれで行っています。 ベンチ外でのコロニーピックは聴いたことありませんんえ。

(無題) 削除/引用 No.3940-2 - 2011/02/04 (金) 17:00:18 - ~ そもそも、動物細胞培養の実験書で、クリーンベンチ外での操作を推奨している本は無いと思いますが、誰がその実験をデザインしたのでしょうか？ 初心者を自覚されているのでしたら、1冊くらいは読んでおいてはいかがでしょうか。 ●薄く撒いて、顕微鏡を使わなくてもピックアップできるようにする。 細胞株によっては見えにくいなどがあるのかもしれませんが、10cmディッシュで数百個/dish程度のコロニーが出来るように段階希釈して撒いておけば、 目視でピックアップできるでしょう。 ●顕微鏡を殺菌し、クリーンベンチ内に持ち込む。 がんばれば出来るかもしれません。

培養細胞での安定発現株の樹立 削除/引用 No.3940-1 - 2011/02/04 (金) 16:41:23 - ひよっこ こちらのフォーラムをいつも参考にさせていただいています。 現在、ヒト由来の培養細胞（ライン化されたもの）用いて実験を行っています。 CMVプロモーターを用いたプラスミドを作製し、リポフェクションにて導入後、抗生物質でセレクションを行い、単一コロニーになるまで培養を行いました。 その後、それらの単一コロニーを24穴プレートにピックアップする際に、クリーンベンチ外の顕微鏡下で、ピペットマンを用いてコロニーをピックアップしたのですが、酵母らしきものがコンタミしてしまいました。 できればクリーンベンチ外での操作は避けたいのですが、何か良い方法はないでしょうか。 次回は、96穴プレートを用いて、1細胞/1ウェルになるように希釈してまくことも考えているのですが、１細胞のみだと細胞の増殖に影響するのではと思い、質問をさせていただきました。 酵素学専門のラボで、自分を含め周りも細胞実験の初心者なので、経験者の皆さんのご意見をいただけたらとおもいます。 よろしくお願いいたします。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---