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MoAbの客観的評価 トピック削除
No.3952-TOPIC - 2011/02/07 (月) 16:06:16 - ハイブリドーマ。
現在、ハイブリドーマ細胞をマウス腹腔に接種して、腹水化させたMoAbを精製しております。

 一般的に、モノクロ抗体の評価法として、ELISA法などで抗原特異性、親和性、IFE法にてpIなど解析しておりますが、そのほか、抗体の性質を決定付ける解析法等あればご教示願います。たとえば、糖鎖解析ですとか、側鎖のアミノ酸解析など。

 また、IFF法で腹水から精製したモノクロを解析した結果、複数のバンドが見受けられ、恐らく、モノクロであっても側鎖アミノ酸や糖鎖修飾の違い等によってpIが多少異なる集団を形成しているものと考えております。そこで、疑問ですが、同じハイブリドーマ細胞を使っても、宿主のマウスが違えば、糖鎖修飾などのエピジェネティックな変化は毎回異なってくるのでしょうか?併せてご教示願います。
 
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(無題) 削除/引用
No.3952-7 - 2011/02/08 (火) 12:32:28 - ami
>精製は免疫抗原を固相化したgelを用いて精製しておりますので、ホスト由来のIgGの混入はあまり考えられないと思います。

そうおっしゃる根拠というのはコントロールの腹水などを抗原カラムに供しても全く何1つノンスペが精製されてこないという予備検討に対する信頼ですか?

>一番知りたいことは、同じハイブリドーマ細胞から産生されるモノクロIgGでも、IgG一分子レベルで見ると糖鎖修飾など異なる集団であるのか?ということです。また、この修飾のパターンはどのホストを用いても常に一定の確率で起きるのかということです。

これはおそらく十分にあり得ます。
例えば栄養状態でも糖鎖修飾は大きく変わります。
O-GlcNAc修飾などが有名ですね。
抗体のfoldingやsecretionを保障するため必要最低限の修飾はあるでしょうが、それ以外は結構培養条件でも影響受けやすいです。

ちなみに、コマーシャルで購入した精製モノクロではIFEではシングルバンドであることは当然に確認済みなんでしょうかね?

>また、二点目ですが、現在はヌードではなく、普通のアルビノマウス(Balb/c)を使用しています。これだと、宿主由来のIgGの混入も考えられますが、上記にあるように特異的な精製を行っておりますので混入はエスケープできるものかと。

これは賛同いたしかねます。
通常のマウスにハイブリドーマを打ち込めば普通は拒絶されます。
がおそらくMHCは一致させているのでしょう。拒絶は起こらない系なんですね。

ただ、そのハイブリドーマはホストの体内で莫大な量の「ハイブリドーマが産生する(一次)抗体」に対して(二次)抗体を産生しているでしょう。

つまりその抗原カラムで精製したものは、実は[抗原特異的抗体]の他に、[ハイブリドーマ由来抗体特異的抗体]が一緒に結合した状態で精製されているでしょうね。

(2次)抗体の場合には当然ポリクロでしょうから非常に多様なホスト由来の抗体が一緒に精製
してきてしまっているでしょうね。

ちなみに私は偽物のamiです。

ありがとうございます。 削除/引用
No.3952-6 - 2011/02/08 (火) 10:07:46 - ハイブリドーマ。
みなさまのご意見を集約すると、
腹水から精製したIgGのpIがラダーで出てくることは、
ホスト由来のIgGが混入している恐れがある、というのが一点。
そして、ヌードマウスを用いれば、ホスト由来のIgGの混入が極力回避できる、とうのが二点目。

 まず、一点目に関してですが、
精製は免疫抗原を固相化したgelを用いて精製しておりますので、ホスト由来のIgGの混入はあまり考えられないと思います。一番知りたいことは、同じハイブリドーマ細胞から産生されるモノクロIgGでも、IgG一分子レベルで見ると糖鎖修飾など異なる集団であるのか?ということです。また、この修飾のパターンはどのホストを用いても常に一定の確率で起きるのかということです。これが、ELISAやラテックスなどの試薬の調製の再現性に大きく影響するからです。

 また、二点目ですが、現在はヌードではなく、普通のアルビノマウス(Balb/c)を使用しています。これだと、宿主由来のIgGの混入も考えられますが、上記にあるように特異的な精製を行っておりますので混入はエスケープできるものかと。

 最後に、評価法に関しても何かアドバイス頂けますと幸いです。

(無題) 削除/引用
No.3952-5 - 2011/02/08 (火) 09:50:55 - ヌード
ヌードにもIgMやIgGはありますよ。

(無題) 削除/引用
No.3952-4 - 2011/02/08 (火) 09:23:34 - mAb
hostはヌードマウスですか?
ヌードならば個体由来のIg混入は極力減らせると思います。

(無題) 削除/引用
No.3952-3 - 2011/02/07 (月) 18:46:00 - ami
No.3952-2に1票

(無題) 削除/引用
No.3952-2 - 2011/02/07 (月) 17:53:22 - ami
はいぶりどーまを作製するために使用したhostのマウスの抗体まで精製したのでは?

MoAbの客観的評価 削除/引用
No.3952-1 - 2011/02/07 (月) 16:06:16 - ハイブリドーマ。
現在、ハイブリドーマ細胞をマウス腹腔に接種して、腹水化させたMoAbを精製しております。

 一般的に、モノクロ抗体の評価法として、ELISA法などで抗原特異性、親和性、IFE法にてpIなど解析しておりますが、そのほか、抗体の性質を決定付ける解析法等あればご教示願います。たとえば、糖鎖解析ですとか、側鎖のアミノ酸解析など。

 また、IFF法で腹水から精製したモノクロを解析した結果、複数のバンドが見受けられ、恐らく、モノクロであっても側鎖アミノ酸や糖鎖修飾の違い等によってpIが多少異なる集団を形成しているものと考えております。そこで、疑問ですが、同じハイブリドーマ細胞を使っても、宿主のマウスが違えば、糖鎖修飾などのエピジェネティックな変化は毎回異なってくるのでしょうか?併せてご教示願います。

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