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(無題) 削除/引用 No.396-6 - 2009/04/26 (日) 07:27:18 - おお 例えばcDNA合成をした段階でRNAとDNAの2本さになっているはずですね。 ということは全くの一本さよりは安定でないかと思うのですが、、 RNAエタチンで保存というのもありかなと思いますね、個人的には。 エタチンの経験がそれなりにあってロスらない自信があるなら、例えば １反応分の量(1ugとか)をエタチンの状態でとっておいて、 RTPCR反応溶液を加えればすぐにできるような状態で保存するのも いいかなと思いました。

アドバイスありがとうございます 削除/引用 No.396-5 - 2009/04/26 (日) 07:10:37 - SS なるほど，2nd strand合成はバイアスはないと考えていいのですね。 でも１本鎖でも保存方法次第では問題ないようですね。 RNAはもう抽出してしまったので，とりあえずcDNAにして保存したいと思います。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.396-4 - 2009/04/25 (土) 16:49:10 - ザンギ 試料数にもよりますが、僕ならRNlaterみたいな保存液中でとっておいて まとめてRNA抽出します。 実験日によるばらつきが抑えられるからです。

(無題) 削除/引用 No.396-3 - 2009/04/25 (土) 16:27:25 - AP なにがあるにせよ、一本鎖でも二本鎖でも、適切な保存すれば一ヶ月くらいな安定性は変わらないと思います。それよりも、保存期間が違うと保存チューブ壁への吸着ロスの度合いが違ってしまって、扱う核酸量が微量の場合や反応系（内部標準の取り方など）によってはバイアスがかかってしまいそうです。その可能性がある場合はキャリア（tRNAとか、poly dI-dCとか）を入れておいたほうがいいかもしれません。 ただし、一本鎖ファージDNAや合成オリゴDNAを扱った経験上、長期保存、凍結せずに溶液保存、凍結融解を繰り返すなどの条件では一本鎖のほうが分解しやすい印象はあります（極性の問題などから想像もできることですが）。市販のPCR用cDNA pool (ClontechのQuick clone cDNAなど）が二本鎖にしてあるのもそういうことがあるのではないでしょうか。 >とは言え，定量をする事を考えるとなるべくステップは少ない方がバイアスが減ると思うので，できれば１本鎖で保存しておきたいのですが， 一般的には逆転写効率は反応ごとのばらつきが大きいのに対して、DNA dependent DNA polymerase反応の2nd strand合成は、サンプルによらず1st strandの鋳型利用効率がほぼ100%なので、これによってバイアスがかかるとは考えにくいです（もしそういうことがあるなら、一本鎖cDNAからスタートしたって、PCRの時の反対鎖の合成効率の違いによるバイアスが問題になるでしょう）。

(無題) 削除/引用 No.396-2 - 2009/04/25 (土) 08:29:32 - Pumpkin 1ヶ月くらい問題ないと思います。マイナス80℃で保存しますよね？ RNAも3ヶ月くらいは保存したものを使ったことあります。ただ、RNAの場合、保存1年後にアジレントのバイオアナライザーで計測したらRINが落ちていました。その辺りを勘案すると、問題ないかと。 心配だったら、エタ沈状態（遠心しないで）でマイナス80℃に保存しておけばいいと思います。というか1ヶ月くらいなら、RNAをためておいて、一気に定量PCRでもいい気がしますが。

１本鎖cDNAの安定性 削除/引用 No.396-1 - 2009/04/25 (土) 01:29:57 - SS RNA実験にあまり慣れていないので初歩的な質問です。 mRNAの定量をしたいのですが，１本鎖cDNAの安定性はどれ位あるのでしょうか？ 以前別のラボでmRNAの定量をしていた時は，１本鎖のcDNAをそのまま鋳型にしてリアルタイムPCRをしていました。しかし，今回，リアルタイムPCRで定量するまでにサンプルを１ヶ月ほど溜める必要があるのですが，その場合１本鎖ではなくて２本鎖にして保存した方が良いのでしょうか？ とは言え，定量をする事を考えるとなるべくステップは少ない方がバイアスが減ると思うので，できれば１本鎖で保存しておきたいのですが，もし２本鎖のバイアスより１本鎖の不安定性が大きいのであれば，２本鎖で保存しようと考えています。何か良いアドバイスがあればお願いします。

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