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(無題) 削除/引用 No.406-34 - 2009/05/21 (木) 15:05:04 - おお >[Re:33] 苦労人さんは書きました : > もう一つ質問させてください。 > > >当然 30bp のバンドは見えないが、泳動先端付近を適当に切り抜く > ゲル片の上清を等量混ぜてライゲーション > という手順でした。 > > この方法の場合、最後にシーケンスは必要ですか？ > 私達のラボでは、普段は制限酵素のみで確認してます。 ちょっと短すぎるので確認の仕方によっては怖いなあっと おもいました。 100bp位のを入れたりすると場合によってタンデムに つながったのが入ってたりたまにします。これは電気えいどう した時複数入ったものがあれば、バンドの強さなどで 判断がつきます。 なるべくなら配列を読まれた方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.406-33 - 2009/05/20 (水) 23:39:56 - 苦労人 もう一つ質問させてください。 >当然 30bp のバンドは見えないが、泳動先端付近を適当に切り抜く ゲル片の上清を等量混ぜてライゲーション という手順でした。 この方法の場合、最後にシーケンスは必要ですか？ 私達のラボでは、普段は制限酵素のみで確認してます。

(無題) 削除/引用 No.406-32 - 2009/05/20 (水) 04:56:09 - 苦労人 >CJさん それなら安心です。 うちのボスのポリシーなのか、PCRで増やした断片以外は読まなくていいようです。 おそらくお金の節約でしょう。 >おおさん、APさん Ampに特有なんですね。 あまり長時間インキュベートはよくないですね。

(無題) 削除/引用 No.406-31 - 2009/05/19 (火) 12:38:21 - AP z>サテライトがたくさんあると、本物のコロニーだけを拾うのって難しくないですか？ サテライトコロニーというのは、Amp耐性菌がコロニーをつくったあとに、周辺のAmpが分解されて耐性プラスミドを持たない菌が遅れて増殖し始めてできる、衛星状のコロニーです。Ampが静菌的（菌を殺さないが増殖を抑える）であるため、Amp濃度が下がっていくと非耐性菌が増え始めるのです。 耐性菌のコロニーの周りに近接して生じているのではなく、一面に小さいコロニーがあるという状態でしたら、Ampの濃度が低すぎるか、Ampが劣化しています。Ampは粉末状態でも溶液でも、保存期間や保存状態によっては劣化して力価が落ちるので要注意です。

(無題) 削除/引用 No.406-30 - 2009/05/19 (火) 06:54:35 - おお >[Re:27] CJさんは書きました : > 小さいのはサテライトコロニーでしょうか。 > 抗生物質の枯渇によって生じるプラスミドを含まない大腸菌だとか。 AMPの時はよく起こります、特にインキュベーションの時間が ながくなると。 カナマイシンの時は殆どおこりません。

(無題) 削除/引用 No.406-29 - 2009/05/19 (火) 06:47:12 - CJ 私は専門家ではないので正しいか知りませんが： プラスミドを含んでいないやつが少し混ざったとしても液体培養→ミニプレップの過程で除外されるから気にしないでいいのでは？ シーケンスはしなくていいんですか？

(無題) 削除/引用 No.406-28 - 2009/05/19 (火) 06:26:56 - 苦労人 >小さいのはサテライトコロニーでしょうか。 抗生物質の枯渇によって生じるプラスミドを含まない大腸菌だとか。 そうです。サテライトコロニーです。抗生物質の枯渇が原因だったんですね。 サテライトがたくさんあると、本物のコロニーだけを拾うのって難しくないですか？ サテライトコロニーを一緒に拾ってたとしても、最後に制限酵素処理で確認して問題なければ、大丈夫なんですよね。

(無題) 削除/引用 No.406-27 - 2009/05/19 (火) 01:35:07 - CJ 小さいのはサテライトコロニーでしょうか。 抗生物質の枯渇によって生じるプラスミドを含まない大腸菌だとか。

(無題) 削除/引用 No.406-26 - 2009/05/19 (火) 00:52:59 - 苦労人 みなさん、どうもありがとうございました。ようやくポジティブなクローンをゲットしました。 プレートに2つしかまともなコロニーがなく、その他のコロニーは小さな使えないコロニーだったので焦りましたが、二通りの制限酵素処理で正しいパターンを示したので、大丈夫ですよね。 ところで、たまにプレート上にdot上のすごく小さなブツブツのようなコロニーが生えることがありますが、あれば何なんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.406-25 - 2009/05/17 (日) 13:20:38 - おお >[Re:24] 苦労人さんは書きました : > >おおさん > > Quiagenのkitで精製してますが、DNAの中にRNAが混じってるんですか？ > 多分大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.406-24 - 2009/05/17 (日) 13:17:03 - 苦労人 >APさん 親切なアドバイスありがとうございます。 >おおさん Quiagenのkitで精製してますが、DNAの中にRNAが混じってるんですか？ 正直60bpでこんなに苦労するとは思ってなかったので、 戦略を変更したくなってきました。

(無題) 削除/引用 No.406-23 - 2009/05/17 (日) 11:26:06 - おお だいぶ、短いDNA断片を使う時に注意が蓄積されていて あまり書くことはないようですが、あえていくらか書くとすれば、、、 多分ご存じと思いますが、5kbpのプラスミドから50bpのDNAを切り出そうとした場合1ugのプラスミドから10ngのDNAが得られるわけです。これはEtBRでは検出限界ぎりぎりです。少なくても5ug、できれば20ugくらいからスタートすればEtBrでもなんの苦労もなく検出できるかと思います。ただし、このあたりは不完全に消化されたRNAなどがシグナルとして見られることがある領域なので、RNAの除去をしっかりやらないと行けないかと思います(もちろん精製法とかのよりますが)。 あと短いDNAはえたチンでロスしがちです。60bpですのでそんなになくなったりというほど短くはないと思いますが、えたチンするのであれば、エタノールを加える前にMg++が10mMくらい含まれているような状態であるようにするほうが無難です。 例えばそのインサートを外のプライマーからPCRして、酵素でカットして60bpを得るなら大腸菌からプラスミドをしこたま精製するよりは効率がいいかもしれません。 微妙なところですね、EtBrで見えなくてもモルベースでは結構な量あるわけですし、見えないけどその領域を切って抽出してきたDNAを使えばうまく行くはずですので。

(無題) 削除/引用 No.406-22 - 2009/05/17 (日) 10:22:10 - AP >染色中、シェイカーなどでゆっくり振るほうがいいのでしょうか？ そのほうが若干早く飽和するでしょうが、静置でも充分です。 私の助言としては、EtBr溶液を持ってベンチやらシェーカーやら流しやら、あちこち移動したり、シェーカーにかけたりすると、事故によってこぼしてしまう可能性が高くなるので、やらなくてもできることはしないほうがいい、ということです。 なお、振るにしても振らないにしても、エチブロ染色液を入れた容器は、さらに大きく安定したバットなどの容器に置き、移動の必要があるときもバットごと持ち運ぶようにすると安全です。 >エチブロ入りのゲルを更に後染めしても大丈夫ですか？ もち、OKです。

(無題) 削除/引用 No.406-21 - 2009/05/17 (日) 00:14:37 - 苦労人 >APさん 了解しました。 染色中、シェイカーなどでゆっくり振るほうがいいのでしょうか？ エチブロ入りのゲルを更に後染めしても大丈夫ですか？

(無題) 削除/引用 No.406-20 - 2009/05/16 (土) 14:27:38 - AP 泳動バッファーに、通常のworking concentrationの0.5 ug/mL程度のEtBrを加えます。泳動バッファにEtBrを入れてしまうと、EtBr使用量や廃液量が多くなるし、汚染の範囲や事故のリスクが高くなるのでおすすめしません。ゲルがギリギリつかる程度の水かバッファー中で後染めするほうが洗練されていると思います。ゲルの硬さ、厚さによりますが、アガロース濃度1 %前後なら10-15分程度、3-4%なら30-60分程度、浸けて放置しておけば染色飽和します。

(無題) 削除/引用 No.406-19 - 2009/05/16 (土) 12:58:20 - 苦労人 >おおさん、APさん コメントありがとうございます。 検討してみます。 EtBrは後染めは、やったことないです。 EtBrを泳動バッファーに入れるというのは、 普通に一滴ほどのEtBrをバッファーのマイナス側に たらすという感じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.406-18 - 2009/05/16 (土) 11:23:10 - AP >ちなみに150bpはゲルの切り出しから精製は可能ですか？ 一般的には十分な大きさですので大丈夫だと思いますが、どのような性能のキットを使うかによりますので、能書きを確認してください。 シリカ吸着タイプでポピュラーなキアゲンのシステムでは、精製可能範囲は70 bp以上、上限はバージョンによって4 kbあるいは10 kbです。 http://www1.qiagen.com/Products/DnaCleanup/GelCleanup.aspx また、60 bpくらいでも高濃度のアガロース（たとえば4%)ならシャープなバンドになるはずですので、EtBr染色で目視して切り出すのも無理ではないです。NuSeiveなど低分子分離用のアガロースならなおいいでしょう。 バンドが10 ngあれば見え、見たい60 bpの断片が3 kbのプラスミドに入っているなら50倍、500 ng以上使えば十分な計算です。 EtBrは後染め、あるいは泳動バッファにも入れておく方法でないといけません。EtBrは核酸とは逆に移動するので、EtBr入りのゲルだと低分子量側からEtBrが抜けてしまって、60 bpくらいだと簡単に見えなくなってしまうでしょう。 >すっぽ抜けとは何でしょうか？ eluate、flow-throughのことです。限外ろ過膜を用いた精製は一般的には、ある分子量以下の夾雑物ををflow-throughとして cut-offして、メンブレン上に残った高分子のものを精製、濃縮しますが、この場合、高分子の夾雑物をメンブレン上に残して、目的の低分子量DNAを flow-throughに回収するという戦法です。 ここにあるガイドブック（PDF)の核酸アプリケーションの項を見ますと、 http://www.millipore.com/techpublications/tech1/tp0040en00 63ページに分子量カットオフ値と、それに対応するDNAの塩基数が出ています。60 bpなら50K以上を使えばflow-throughに出てきて、高分子量のベクター断片はフィルター上に分離できるはずです。 また、分子量カットオフをする限外ろ過膜ではなく、脱粒子膜によってアガロースゲルと溶出液を分離する方法も載っていますので参考に。 >簡単そうですね。一分くらい遠心すればいいですか？ たとえば、Trends in Genetics, vol 8 (1992)のtechnical tipsのコーナーに記事が出ています。穴をシリコナイズしたろ紙片でふさいで使う変法ですが、3 krpm, 5 minになっていたと思います。ろ紙を使わないとゲルの硬さによってはアガロース片が落ちてくる可能性があるので、より低速に調整する必要があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.406-16 - 2009/05/16 (土) 08:35:00 - 手抜き > なるほど。ゲルを精製しないで、ライゲーションですか？ > 初めて聞きました。 例えば以下をご覧ください。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/tech_info_detail2.asp?unitid=U100003434&masterid=M100001907 これはフィルター付きカップを使う方法ですが、原理は同じです。 実際にはこの10分の1スケールで実験していますが、充分なコロニーが生えてきています。 > でも、そこに含まれてるDNAは超微量ではないんですか？ もちろん量としては微量ですが、モル数としてはサブクローニングに充分な量ですよ。 > 特別なキットが必要ととかではなく、エッペンチューブのみでできるんですよね。 私はそうしています。必要なのはエッペン１本だけです。

(無題) 削除/引用 No.406-15 - 2009/05/16 (土) 03:00:09 - 苦労人 >ゲルをエッペンに入れて軽く遠心し、表面に染み出してくる液のことです。 なるほど。ゲルを精製しないで、ライゲーションですか？ 初めて聞きました。でも、そこに含まれてるDNAは超微量ではないんですか？ 特別なキットが必要ととかではなく、エッペンチューブのみでできるんですよね。 >60塩基くらいなら全長の合成をオーダーしてしまったほうがいいでしょう。 次回からそうします。オリゴを使う場合もシークエンスは読まないとだめですよね。 >プラスミドベクター　VS 60 bpインサートなら、サイズの差が大きいので、ゲル電気泳動で切り出すのではなく ちなみに150bpはゲルの切り出しから精製は可能ですか？ >どうせ泳動像で確認できない、確認しないのなら、すっぽ抜けをそのままligationに使えばいいんじゃないでしょうか。 すっぽ抜けとは何でしょうか？ >底にピンホールあけたエッペンチューブにゲル片を入れて、別のチューブに差し込んで遠心分離するなどの小技 簡単そうですね。一分くらい遠心すればいいですか？

(無題) 削除/引用 No.406-14 - 2009/05/15 (金) 11:10:06 - AP ああ、PCR産物を一旦プラスミドに入れるところまではいったんですね。そこからの切り出しができないと。 プラスミドベクター　VS 60 bpインサートなら、サイズの差が大きいので、ゲル電気泳動で切り出すのではなく、制限酵素消化物をそのまま遠心限外濾過膜にかけるだけできれいに分離できそうですが。どうせ泳動像で確認できない、確認しないのなら、すっぽ抜けをそのままligationに使えばいいんじゃないでしょうか。 それと、ゲルからの精製システムは、適用できるサイズの範囲があるので、極端に短いとか長いものはうまくいかない場合があります。シリカ系のマトリックスに吸着させる方式だと、くっつかないか、一度くっつくと溶出できないかどちらかで、収量0でもおかしくないくらいです。ゲルからの切り出しをするなら手抜きさんのいうように、ゲル片から水分を分離して溶出する方法がいいでしょう。タカラなどから分離を容易にする遠心ろ過膜も売られていますし、底にピンホールあけたエッペンチューブにゲル片を入れて、別のチューブに差し込んで遠心分離するなどの小技もあります。

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