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(無題) 削除/引用 No.41-11 - 2009/02/18 (水) 23:28:33 - Pumpkin RNAが取れているかどうかの簡易的なチェックとしては、TAEで非変性RNAを流します。rRNAの輝度を見るのには十分です。ホルムアミドとホルムアルデヒドをローディングダイと混ぜて加熱して変性させてから、TAEアガロースで流すこともありますが、非変性/TAEでチェックで問題ありません。最近は、アジレントのバイオアナライザーでチェックしてしまうのでやりませんが。 RNase不活処理する場合にDEPCを使うことがありますが、Trisなどとは反応してしますが、MOPSではDEPC処理できますので、電気泳動バッファーのように比較的大量に使うものの処理には適しているかと思います。APさんがご指摘のようにアルデヒドはTrisのアミノ基と反応するかもしれません。 で、変性RNAをTAEで流して、それがNorthernで正しい分子量を与えるかどうかはMOPS-変性アガロースゲルでしかやったことがないのでわかりません。

(無題) 削除/引用 No.41-9 - 2009/02/18 (水) 19:55:52 - ami [Re:5] APさんは書きました : > まあ、このフォーラムは、もちっとレベルの高いところを対象にしているといいましょうか、教科書的なこと、実験指南書を読めばわかるレベルのことは十分わかっているけれど、実際的、あるいは本にはあんまり書いていないようなノウハウや実験例をディスカスするところのようですので。 実際的なの専門のサイト作ろうかなぁ･･･と思った。

http:// 削除/引用 No.41-8 - 2009/02/18 (水) 05:36:04 - TK-1 >[Re:5] APさんは書きました : > まあ、このフォーラムは、もちっとレベルの高いところを対象にしているといいましょうか、教科書的なこと、実験指南書を読めばわかるレベルのことは十分わかっているけれど、実際的、あるいは本にはあんまり書いていないようなノウハウや実験例をディスカスするところのようですので。 それはもう過去の話で、最近は困ったちゃんの駆け込み寺か自習のレポートの質問コーナーって感じですね。

(無題) 削除/引用 No.41-7 - 2009/02/18 (水) 00:28:27 - AP Molecular Cloningを読んでいるなら、少なくともformaldehydeのRNAに対する作用はわかりますね。formamideは水素結合を弱め、つまり核酸のTmを下げるのに使われる一般的な試薬です。これでRNAの強固な二次構造をマイルドな温度（55〜70℃）で解離させるんですね。そこにformaldehydeによる修飾が起こると。 歴史的にはMOPSだけでなくリン酸バッファーなども使われていました（Molecular Cloningに記載の参照文献も見てみましょう）。TrisがだめなのはTrisはアミンなので（しかもバッファーとなる基がアミン）、アルデヒドと反応して緩衝能が損なわれるからでしょう。 formamideで変性したRNAをTAEで流す（formaldehydeぬき）という方法を提唱している10年くらい前の論文も見つけましたが、普及していないようですね。

(無題) 削除/引用 No.41-6 - 2009/02/17 (火) 22:39:19 - てん。 ありがとうございます。 今後はもっと自分自身で調べたいと思います。 今回の件については、 おしかりを受けてから、Molecular cloningや 他の教科書を見たのですが、 以下のことが疑問です。 なぜ、RNAはTBEやTAEではいけないのか？ 簡易のチェックならTBEやTAEでも良いとのことですが、 MOPSを緩衝液に使用するのはなぜか？ ホルムアミドやホルムアルデヒドで 変性ゲルを作製するとき、 Tris baseの緩衝液では何か不都合な点でもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.41-5 - 2009/02/17 (火) 20:42:29 - AP まあ、このフォーラムは、もちっとレベルの高いところを対象にしているといいましょうか、教科書的なこと、実験指南書を読めばわかるレベルのことは十分わかっているけれど、実際的、あるいは本にはあんまり書いていないようなノウハウや実験例をディスカスするところのようですので。 どんな参考書を読んだのかわかりませんが、その程度の勉強では人に聞かなきゃならないほど、勉強し尽くしたとは思ってもらわれないでしょう。 他の人も書かれていますが、Molecular Cloningくらいは読んでから来てという感じです（たいていのことはそれだけ読めばでていますから）。 MOPSは何のためなんて聞かれると、生化学の初歩の緩衝液から説明しないといかんのかなと思ってしまいます（答えは、バッファー成分です）。教科書でなくても、試薬のカタログでもMOPSの用途は緩衝液だと書いてあるはずですしね。 いぢわるしてやろうというわけではく、それくらい自分でできなければ、この先、とてもじゃないけれどやっていけませんよ、という親切心だと思っていただければ。

(無題) 削除/引用 No.41-4 - 2009/02/17 (火) 17:48:07 - Pumpkin 悪意がなさそうなので、少しお話しますが、たとえばMolecular cloningというマニュアルがラボに蔵書されていませんか？あれば、chapter7に記載があります。日本語で書かれた本当にプロトコルしか載っていないようなチープなものを参考にするより、洋書でしっかりしたものや原著を参考にしてはいかがですか。すくなくとも、何のために加えるか分からない、反応系が分からない場合にはそのようにして、理解してから実験に着手すべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.41-3 - 2009/02/17 (火) 17:40:38 - てん。 申しわけありません。 おっしゃるとおりです。 ただ、参考書を調べても、詳しくきさいされているものがなく、 疑問に思ったので投稿させていただきました。 釣っているとはどういう意味でしょうか？

勉強してください 削除/引用 No.41-2 - 2009/02/17 (火) 17:33:53 - Pumpkin 失礼ですが、ここで質問される内容ではないと思います。実験参考書をよくお読みになって、勉強してください。それでも分からない点があれば、そこを聞くのならばまだわかります。 厳しく言えば、このような状況で「〜を実験している」とは、良く言えたものですね。ところで、釣っているわけではありませんよね？

MOPSは何のために必要なのでしょうか？ 削除/引用 No.41-1 - 2009/02/17 (火) 16:31:29 - てん。 現在、RNAを使用した実験をしているのですが、 アガロースゲル電気泳動時に加える MOPS bufferを何のためにいれるのか？がよくわかりません。 ホルムアミドやホルムアルデヒドも何のためにいれるのか よくわかりません。 私自身基本的なことがわかっていないことは重々承知ですが、 どなた様かよろしければ教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いします。

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