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(無題) 削除/引用 No.424-38 - 2009/05/18 (月) 14:36:15 - おお >[Re:37] ？？さんは書きました : > なぜ細胞群の話をしているのでしょう。。。。話がややこしくなります。 FACSは細胞群で見ますけど > 蛍光顕微鏡で、時間をかけて１０００個づつの細胞の蛍光強度を適切な方法で測ったとして、 > 違いが「わずか」であったとして、FACSで解析したらその違いが「わずか」では無く > 「結構な違いとして検出できる」ということを議論しているのでは？ そういう議論で、おそらくそういう結論だと思います。 でもすべてのことに重要とおもうのは、あるツールを使う時、その仕組みはどうでどういう風にけん出されて、検出機自体の感度はどうで、とか考えることだともおもいます。 そういう意味でサイトスピンで見られるバックグランドの問題 など、検出の違いからくることも議論されています。 質問者さんに直接回答する形でこの様な話が書かれているわけでないので 若干分かりにくくなってますが、有意義な議論がなされていると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.424-37 - 2009/05/18 (月) 10:28:29 - ？？ 全く同じ蛍光を発している細胞を 蛍光顕微鏡で解析した場合と、FACSで解析した場合 それをどちらがより見やすいかでしょ？ 一分子を検出できる顕微鏡と、検出できない顕微鏡 その違いを言っているのと、同じことを言っているのでは？ なぜ細胞群の話をしているのでしょう。。。。話がややこしくなります。 蛍光顕微鏡で、時間をかけて１０００個づつの細胞の蛍光強度を適切な方法で測ったとして、 違いが「わずか」であったとして、FACSで解析したらその違いが「わずか」では無く 「結構な違いとして検出できる」ということを議論しているのでは？ これだから、やったこと無い人が言うとわけわからなくなるんですよね。。。。

検出感度？ 削除/引用 No.424-36 - 2009/05/16 (土) 07:33:40 - Miso 面白い議論で、大変興味深く読ませていただいてます（FACSの経験はありません）。 ところで、元々の質問である検出感度とは何をさしているのでしょう？ 例えば蛍光顕微鏡では１分子の蛍光分子を検出することができますが、感度としてはそれ以上ないということになります。 しかしコントロールの細胞と、蛍光分子を非常に弱く発現している細胞を一つづつ観察して、違いを検出できるかというと難しいかもしれません。 それに対してFACSは（１分子を検出できるかどうかは知りませんが）、それぞれの細胞を群として比べた場合に、統計的に有意な違いを検出するのに優れていると想像できます。おそらく蛍光顕微鏡でも、時間をかけて１０００個づつの細胞の蛍光強度を適切な方法で測れば、違いがわずかでも、群としての差は検出できるのかもしれません。 もちろんそんなことする人はいませんから、そういう意味ではFACSの方が、細胞群を扱う場合には、検出力と定量性は顕微鏡よりも高いのではないでしょうか。 ふと思ったことを書いてみました。

(無題) 削除/引用 No.424-35 - 2009/05/14 (木) 15:24:17 - おお >[Re:34] 単純にさんは書きました : > どうもお騒がせしたみたいですみませんでした。 > 興味があって聞いていたことです。個人を非難したつもりはありませんでした。 まあ、こういう所は誤解がよくあるので、特にだれが悪いでもまなく、 変な方向に進んだりすることもありますから、発言に気をつけろと 攻めるのは簡単ですが、かといって冷静に総べてをみてしっかり 書くほど、余裕のある方もないでしょうし、、、 質問者がまだ読んでいらっしゃるか分からないのですが、議論である程度 いえることは実際実験で使われているサンプルにおいてFACSの 方が蛍光顕微鏡より感度が高いことがプラクティカルにいえる (理屈で、実は私の屁理屈でそうでないかもしれないといえても)。 サイトスピンでみる時にバックグランドを拾ったり乾燥などで 強く見えることがある。また観察方法に注意する方がいい。 基本的な蛍光顕微鏡の使い方で露光時間をそろえているか というしてきもありますね(これは可也基本的なのでそこで 間違っている可能性はないとおもいますが)。 FACSの条件設定の問題も指摘されています。設定できる スキルがすぐに見につくのはよく分かりませんが、 同じぐらいにひかる他の染色などでちゃんとわけれている のでしょうか? その抗体でひかるポジコンは持ってらっしゃるのでしたっけ、、、 こんな感じで良いですかみなさん。 簡単にまとめたつもりですが、詳細は議論の中でそれぞれに 詳しい人がクリアーに書いてますのでそちらを見てください。 またすべでをフォローできなかったかもしれませんが、、、 こんな感じで仕切り直しできるようにとコメント致しましたので いたがこじれたのをお許しいただければとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.424-34 - 2009/05/14 (木) 07:26:30 - 単純に どうもお騒がせしたみたいですみませんでした。 興味があって聞いていたことです。個人を非難したつもりはありませんでした。 そう感じてしまわれた方がいらっしゃったら、謝罪致します。 申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.424-33 - 2009/05/14 (木) 07:23:24 - 単純に 経験があるような書き込みだったので、そうなのかどうなのか質問しただけです。 単純に、あるかないかを言ってくだされば良かったのですが・・・ 私が免疫・リンパ球屋と勝手に想像されても・・・ 質問者様の参考のために、 私は免疫・リンパ球屋ではありません。もちろん免疫系の細胞も使いますが 検証した細胞は、293やHeLaなど、ごくごく一般的に使う細胞株でも 同じような結果が得られています。

(無題) 削除/引用 No.424-32 - 2009/05/13 (水) 21:27:32 - Tb もうなにもいわない方がいいのかもしれませんが、一応一番最初のコメントとして > FACSでみえないレベルのシグナルが蛍光顕微鏡で見えたというのは少し考え難いかなと思います。 と私は書いています。なにか極端なことを主張しているわけではありません。 単純にさんの場合はおそらく免疫・リンパ球屋だと推測させていただきます。リンパ球系の細胞などは自家蛍光が少ない細胞ですので、自家蛍光が検出感度を決めるということはないのでしょう。ただ、トピ主さんのケースもそういう問題ではなかったようですので、あらためて謝罪するともに、これ以上のコメントを控えさせてもらいます。

(無題) 削除/引用 No.424-31 - 2009/05/13 (水) 14:26:02 - よっしー > 顕微鏡で得られるのがノンスペとして、それがFACSで引っ掛らない > のは何か説明つきますか? FACSの場合，レーザーの強度を調整したり，検出器の感度を調整したり， 蛍光の漏れこみをコンペンセーションで切り捨てたりします． これらを適切に調整しないと，見えるはずのシグナルが見えなくなります． シグナルが弱い時は，ありえる事だとと思います． 逆にシグナルが強すぎると，うまく調整しないと， 発現量がhi,int,lowがみんなhiになってしまったりもします． 使いこなすのはなかなか難しいですね． もちろんふらっとさんと同じような経験も何度もしています． 実際の原因は良く分かりませんが， 私は弱いシグナルは，強くすることが出来るかどうか (露光時間を上げるとかではなく)，S/N比をあげてから， ノンスペかどうかを考えます．

意見というより質問 削除/引用 No.424-29 - 2009/05/13 (水) 14:12:50 - mom-a この状況で、経験のないモノが何かものを言うのは危険なような気はするのですが、トピ主さんへの質問ということで許していただけるでしょうか。 経験のないモノなので、的外れな質問かもしれませんが… >フローサイトメーターでアイソタイプコントロールと同じレベルでも、蛍光顕微鏡だと励起の幅にも拠りますが、「あれ、これはコントロールより光っているのかな」と思うことがあります。 >サンプルのピークはコントロールと一緒でした。しかし、論文検索によってその抗原が発現しているというものが複数あったため、FACS用のサンプルをサイトスピンによってスライドガラスに付着させて蛍光顕微鏡で見てみました。この際、変性、固定等はおこなっていません。すると、わずかですが蛍光があったため、 FACSしたときのサンプルのピークとは、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をとったときの細胞数のピークの位置がコントロール群と処理群で同じという理解でよろしいでしょうか。 一方、蛍光顕微鏡で「コントロールより光っているのかな」という時、コントロール群の細胞は全く蛍光を示していないのでしょうか？うっすらでも蛍光が認められる状態で、コントロールより処理群の全ての細胞が明るいのでしょうか？処理群の中にコントロールよりも明るく見える細胞「も」いるということでしょうか？ FACSで「ネガティブ」のグループに分類される中でも蛍光強度には幅があるわけですが、ネガティブの中での幅を観察しているという可能性はないのでしょうか？顕微鏡での観察をどのようにされているのかわかりませんが、CCD経由の場合、露出の設定などを変えるとかなり弱い蛍光とか、自家蛍光とかが観察できることがありますので、条件によってはノンスペの中での強弱が見れてしまうことはないのでしょうか。 ネガコンとポジコンの両方があると、問題が分かりやすくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.424-28 - 2009/05/13 (水) 13:56:23 - ふらっと ＞顕微鏡で得られるのがノンスペとして、それがFACSで引っ掛らない のは何か説明つきますか? 私に聞かれたのか知りませんが、お答えすると、、、 サイトスピンをした後に、染めたり二次抗体をかけたりもしていないに 細胞が光って見えるということを私はよく経験しています。 なぜか走りませんが、現象として確認しています。 質問者さんの場合、コントロールと比較して光っているとことなので、関係ありませんが、 言いたかったことは、 FACSのサンプルの細胞とサイトスピンした後の細胞は、条件が違うということです。 乾燥するとちょっと変わると私は上記の経験から類推します。

(無題) 削除/引用 No.424-27 - 2009/05/13 (水) 13:47:36 - 単純に 類推と経験をはっきりしてくれるとありがたいのです。

(無題) 削除/引用 No.424-26 - 2009/05/13 (水) 13:44:57 - み >[Re:20] gygyさんは書きました : FACS用のサンプルをサイトスピンによってスライドガラスに付着させて蛍光顕微鏡で見てみました。この際、変性、固定等はおこなっていません。すると、わずかですが蛍光があったため、検出系の違いによる感度がどれだけあるのか疑問に思い、質問させていただいた次第です。 サイトスピンで貼り付けて観察すると、見る細胞によって大きさも異なるでしょうし、蛍光を発してそうなものと、そうでないものが見かけ上散在するのでは。（一応、サイトスピンはうちのラボにもあります） もう一つの可能性として、接着した部分に抗原抗体複合体が集積して（focal adhesionのように？）シグナルが見えたとか・・・。 あまりいい加減なことコメントしたら叩かれるかもしれんけど。 直接的な経験がなくとも推察してコメント出してもいいでしょう。 フォーマルな場じゃないんだし。 研究者だからこそ推察するんじゃないですか？ あっ　別に特定の人にケンカうってるわけじゃないですよ。 「み」も検出力はFACS>顕微鏡で構わんと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.424-25 - 2009/05/13 (水) 13:22:27 - おお >[Re:24] ふらっとさんは書きました : > おおさん > ＞加えてGFPの発現をやっている方と細胞表面の染色をやっている方の > 感覚は違うかもしれませんよ。 > > どうしてそう思うのか、私はわかりません > だから、 > これ以上は、経験のない私は書きません。 なぜ思うかについてはこのとピにだいたい出ているであろうとは おもいますが、それでもそう思わないのならそれ以上は 書いても意味がないと思いますから。 ただGFPでの説明でしたので、質問者様のような経験とかしている 人はいないかとおもい、そういう人にめが留まるような書き方を したかったと言うのはあります。 顕微鏡で得られるのがノンスペとして、それがFACSで引っ掛らない のは何か説明つきますか?

(無題) 削除/引用 No.424-24 - 2009/05/13 (水) 11:32:16 - ふらっと おおさん ＞加えてGFPの発現をやっている方と細胞表面の染色をやっている方の 感覚は違うかもしれませんよ。 どうしてそう思うのか、私はわかりません だから、 ＞抗原や見たいターゲットによって変わりそうだなと、、、、 なにを想定しているのかわからないのです汗 Tbさん ＞トピ主さんの質問が、FACSのPMTと、蛍光顕微鏡のCCD、どちらが何分子の蛍光色素までとらえられる感度があるのか、 取りあえず、この質問がメインだと思います汗 それをやったことがあることで答えればいいのではないでしょうか？ 知識はあることは認めますが、道がそれては質問者様も ＞私にはまだ知識や経験がなく理解できていない部分がありますが、 皆さんの文章を熟読します。 混乱です。熟読しても意味ないかとすら思います。 私の経験からくる感覚ですが FACS>顕微鏡（＞の数はどうでもいいです、大小がわかるように１つにします） です。おおさんが見たデータというのが普段見られています。 それを抑えた後、ノンスペであるとかは質問者様が考えればいかがと。 知識のひけらかしより、経験がものをいう世界じゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.424-23 - 2009/05/13 (水) 11:11:53 - 単純に 落ち着いています。強いて落ち着いていないと思われたのであるのならば、 それは小難しく書かれていて、あまりマトを得ていない回答だったので、 だから、単純に言ってよ、って思っていたからだと思います。 申し訳ありません。 私がGFPの蛍光について述べたのは、単純に「蛍光強度」が比較しやすいと思ったからです。 おっしゃる通り、GFPは一様に存在するので、質問の内容も細胞表面の抗原のも一様に存在するものが多いと思いますので（ラフトとか言い出したらキリがない）、わかりやすいと思ったためです。 さらに、論点がずれると思ったので述べていませんが、蛍光顕微鏡とFACSで共通して使える色素、 細胞内でドット状に局在する抗原、核にドット状で局在する抗原（１個とか２個ではないです）（これらはGFPタグののついたものでGFP検出感度で比較もした）においても同じ結論を見ています。私がした中では。 ＞顕微鏡観察の目的は形態あるいは構造観察であり、 違うんです。私は蛍光強度の比較のためだけの実験もしたことがあるのです。 書かなかったのが悪いと思いますが。 Eireさんがおっしゃる ＞細胞表面の抗原を検出する際の感度についても同じことがいえるのでしょうか？ 同じです。というか、何故違うかもしれないとお疑いなるのかが、正直言うと私にはわかりません。FACSで検出をどのように考えておられるとそういう風に疑問にもたれるのか予想できないです。バカにしているのではありません。 そいういう切り口で来られる方に説明するにはGFPではダメだと考えるほど想像力がないのです。 そういうことですので、GFPが代表として良いだろうと思ったのです。 そういう私ですので、私の経験と違うことを知っていらっしゃる方がいるみたいなので、 是非是非知りたいと思い、書き込んだのでした。 質問者様をないがしろにして申し訳ありません。 で、又申し訳ありませんが、 Tb様の ＞そういうのではなくフォーカルコンタクトとかをつくる接着分子なら、蛍光顕微鏡でも結構みえますよ、という程度です。 それをFACSで見た場合と蛍光顕微鏡で見た場合との比較をされたことがあるのでしょうか？ 私は、以前からそういう経験があるのかということを匂わせるコメントに質問をしているですが・・・。 経験を知りたいだけです。冷静です。

(無題) 削除/引用 No.424-22 - 2009/05/13 (水) 10:03:07 - よっしー しばらく見ない間に私のコメントに対して ご指摘，ご批判があったようで，失礼しました． 私が言いたかったのは，細胞表面抗原に対する抗体で染色した， 全く同じサンプルを測定した場合，FACSの方が，低いシグナルを 捉える事が出来るのではないかという事です． FACSではシングルレーザーの場合PE-Cy5のようなタンデム色素は よく使うと思いますが， 蛍光顕微鏡でシグナルを捕らえることは不可能でしょう． 他にもいろいろ私なりの理由はあるのですが， 本題とは関係ないので，割愛します． さて，トピ主さんはFACSでシグナルが見え無かったそうですが， どの様な腫瘍細胞が分かりませんが，その細胞は自家蛍光が強くないですか？ どうもコンペンセーションやレーザーの強度の設定が うまくいっていないような気がします． 昔に付着細胞で同じような経験をしました． 一度確かめられてはどうですか？ もうひとつの可能性は，顕微鏡観察がノンスペを見ているかもしれません． 無標識の抗体(アイソタイプマッチのネガコンも)で１度処理した後に， 標識抗体をのせて,シグナルが消えるかどうか確かめる． あるいは，うっすら染まっているものをはっきりさせるために， 無標識の1次抗体後に標識2次抗体をのせるとか． その方がシグナルが強くなります． また，FITCではなくAlexaシリーズにするとか． いずれにしても，どちらの結果が正しい結果なのかを， 見極めることが大切ですね． うまくいくときはいいですが，はまるとどちらの手法も大変ですよね． がんばってください．

(無題) 削除/引用 No.424-21 - 2009/05/13 (水) 03:17:27 - おお 余計な発言で混乱させてしまったかもしれません。失礼しました。 経験がないといいましたが、こんな学会での発表を見たことがあります。 たしかGFPをレポーターとしてつかった実験で、FACSで展開して、横軸 にインテンシティーをしめし、彼らはコントロールとワンオーダー違うポピュレーションを回収したといっていました、それをコンフォーカルで、なんとなく染まっているか染まってないかというイメージを示していたのを思い出します。 このポピュレーションはサイドFACSでチェックするとクリアーに 発現してない細胞よりクリアーに蛍光強度がシフトしており 検出感度がFACSの方が優れるのかなという感覚を持たせるデーターでした。 えっと、そこでとピ主さんは逆の例を経験されたということですよね。 なので、これがテクニカルに何かまずい事が起こっているのかとか、 そういう場合がありうるのかとかいう話をした方がいいのではと思いますが、、、 加えてGFPの発現をやっている方と細胞表面の染色をやっている方の 感覚は違うかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.424-20 - 2009/05/12 (火) 22:29:11 - gygy 皆様、たくさんのコメントありがとうございます。 私の理解をはるかに超えた内容で、ちょっとびっくりしております。 私の状況をもう少し詳しく書きますと、 あるリンパ球系浮遊腫瘍細胞をFITC-IgG1コントロール又は、FITC-該当抗原抗体でますFACSしました。そのときは、サンプルのピークはコントロールと一緒でした。しかし、論文検索によってその抗原が発現しているというものが複数あったため、FACS用のサンプルをサイトスピンによってスライドガラスに付着させて蛍光顕微鏡で見てみました。この際、変性、固定等はおこなっていません。すると、わずかですが蛍光があったため、検出系の違いによる感度がどれだけあるのか疑問に思い、質問させていただいた次第です。 上記のような状況ですと、抗体間の特異性の違いも関係するのでしょうか。

すいません。感覚的表現でした 削除/引用 No.424-19 - 2009/05/12 (火) 22:02:49 - Tb > FACS>>>蛍光顕微鏡 に関して感覚的表現としてしか受け止めませんでしたので、">"がいくつかに関してもまったく主観によるもので、それ以上のことをいってしまったならば、訂正させていただきます。 > FACSと蛍光顕微鏡で観察するサンプルが同じ条件でないと比較できないっすよ。 申し訳ありませんが、ここでまず食い違ったようです。おそらく単純にさんはまず培養細胞を単細胞に調製し、FACSと同様に染色したあと生細胞をかカバーグラスに垂らして顕微鏡観察に持って行くことが条件とお考えのようです。しかし、顕微鏡観察の目的は形態あるいは構造観察であり、接着細胞に関してはがして、固定なしに染色することは意味をなさないということから、基本的にはカバーグラス上に培養された細胞をそのまま固定・染色しその後定法に従い退色防止剤入り封入剤で包埋することを想像していました。さらに、怒られそうですが、蛍光顕微鏡の感度を求めるならば、退色に強い色素を（FACS機器に対応するかどうか考えず）選ばせてもらって、できる限り長時間積算することも。局在ということを申しましたのは、おおさんが書いてくださいましたように、GFPだと細胞内に一円に存在するわけで、CCDピクセルあたりの蛍光分子が圧倒的に少なくなりますので、そういうのではなくフォーカルコンタクトとかをつくる接着分子なら、蛍光顕微鏡でも結構みえますよ、という程度です。このような点ですでに感覚的比較の意味しか持ち得ませんでした。GFPに関してもよくみえますよ、ととれる書き方をしてしまったならば、撤回し、お詫びさせていただきます。 トピ主さんの質問が、FACSのPMTと、蛍光顕微鏡のCCD、どちらが何分子の蛍光色素までとらえられる感度があるのか、というものであれば的をはずしており、トピ主さんを混乱させてしまったことを申し訳なく思います。 ところで、トピ主さんの状況は、コントロール染色でも蛍光顕微鏡では染まって見えるような気がする、というものです。すなわち、なにかが光って見えるわけで、これは検出器の感度云々の問題ではなく、染色方法の違いによるノンスペか、あるいは自家蛍光が強く特異染色が隠れてしまっているのではないか、というのがそもそものコメントをつけたはじまりでした。これに関しては自家蛍光がトピ主さんのケースではないのならば、推測がばはずれたということでお詫びさせていただきます。

落ち着きましょうよ 削除/引用 No.424-18 - 2009/05/12 (火) 17:58:05 - Eire >単純に さん 少し落ち着かれませんか？ おおさんは、最初のコメントできちんと「この手の実験は経験がないですが」と前置きされてますよね。 それに対して >その感覚というのが、実際に経験したことからなのか？ >ということをお聞きしたいのです。 と質問されても、おおさんも答えようがない（というか、始めに断っているのに、と思うしかない）と思うのですが。 議論と関係ないことですみません。ですが、気になったので書かせていただきました。 本来の議論にもどって、私もおおさんと同じく FACS の経験がないので興味深く読ませていただきました。 GFP の検出感度についてはそんなにも差があるのですね。勉強になりました。ありがとうございます。 ところで、このことは gygy さんの質問である、細胞表面の抗原を検出する際の感度についても同じことがいえるのでしょうか？ 比較実験をされたことがおありであれば、そちらの結果を教えていただけると、より直接的な回答になって良いのにな、と思います。

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