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(無題) 削除/引用 No.45-10 - 2009/02/22 (日) 22:30:21 - 通りがかり 細い突起が固定や洗浄中に切れて、そこから抗体が細胞内部に入り込んだとか？ DRG 組織が染まるのも同様。 一次抗体なしでバックが上がるというのも、二次抗体が細胞中に入り込んで残留してそう。

(無題) 削除/引用 No.45-9 - 2009/02/22 (日) 16:03:00 - RSC homers様、AP様 確かにそうですね。 エタノールを含めずに、PFAを溶液から調整し再度検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.45-8 - 2009/02/20 (金) 09:29:44 - AP 免疫染色での界面活性剤の役割はいろいろありますし、目的に応じて使われる種類や濃度もいろいろです。ひとつは、非特異的吸着を防いだり洗浄を促したりです。もうひとつは、抗体の浸透性を高めるということで、ご質問はこの点に関するものですね。 一般的は固定中、あるいは固定後の前処理で、有機溶媒や濃いめの界面活性剤で（0.5% TX100など）透化処理しますね。でも固定法や前処理の仕方（細胞膜の保持され具合）、標的タンパク質によっては、透化処理をしなくても染まることもあるでしょう。逆に、膜タンパク質だと透化処理によって溶出してしまって染まらなくなる場合もあります。 今回は、特に透化処理をしなくても染まる条件だったのでしょう。TX100の濃度の情報がありませんが、ブロッキングの時に加える濃度というのは透化処理に使うより低い場合が多いので、最初から透過性には関係がなかったんでしょう。固定、前処理の段階ですでに十分な透化が起こっていたんでしょうね。 透化、未透化で比較をするなら、膜のバリアを保ったまま固定する必要があるでしょう。フォルマリンは安定剤（重合防止剤）としてメタノールが含まれています。ブランドによってはかなり濃くて、膜タンパク質が流出してしまうことがあるくらいです。これによって適度な透化が起こっているのかも知れません。PFAから水溶液を作ればアルコールフリーです。固定後の処理によっては膜が壊れるかも知れません。例えば、いったん乾燥させているとか。 標的が膜タンパク質ですので、透化処理によって抜けてしまう可能性もあるので、条件検討が必要になるかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.45-7 - 2009/02/20 (金) 01:45:18 - Homers 市販のホルマリン37%液にはエタノールが含まれていましたよね。有機溶媒による膜の溶解が起るのでパラホルムアルデヒドを調製して行なった記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.45-6 - 2009/02/19 (木) 21:29:23 - RSC ape様 確かにそうではあるんですが・・・うちはあまり信用しない人が多いみたいで色々やってます。 のーと様 参考文献を教えて頂きありがとうございます。 そういう方法もありですね。 一応、抗原エピトープを購入して、免疫染色を行って確認することになりました。 やま様 抗体に問題ないのであれば、ブロッキングの方法を変えてみるのがよいと思います。 論文でもTritonを入れてwashしてたり、PBSだけでwashしてたり、様々みたいで、方法も部位や細胞によるみたいですね。 名無し様 固定法はホルマリン固定です。 そのようなことを知りませんでしたので、大変勉強になります。 おかげさまで色々と考える材料ができました。

(無題) 削除/引用 No.45-5 - 2009/02/19 (木) 10:39:27 - 名無し 固定法はなんでしょうか。もしメタノールやアセトンのような有機溶媒による固定で行われているなら、この段階で大部分の膜脂質は溶けてしまっていますから本来膜内にある部分であっても抗体はアクセスできると思います。よって、界面活性剤処理なしでも普通に染まると思います。もしホルマリン固定ならば、どういう機序で染まったのかすぐには思いつきませんが、固定に伴い何か脂質や蛋白質自身の構造等に変化があってエピトープがうまい具合に膜の外側に出たのかもしれません。近くの蛋白質同士を架橋したり（脂質や糖に対するホルマリンの作用は正確な知識がありませんが、とても反応性の高い試薬なのでたぶんありえるのではないかとおもいます）しますので膜内部でのこの蛋白質の生理的な蛋白質の配置や動きに変化が生じている可能性はありえるようにおもいます。 あと細胞の蛍光抗体法の場合、界面活性剤処理は細胞膜を壊して抗体が細胞内に入りやすくするのが第一の目的と思います。

(無題) 削除/引用 No.45-4 - 2009/02/19 (木) 02:48:28 - やま 私もある膜タンパクを染めております。 トライトンXなどは膜透過性処理のためだと認識しておりました。 私の目的のタンパクは、腎臓ではきれいに管腔側にあることまで確認できるほどきれいに染まりますが、存在がわかっている別の臓器では一応染まるんですがノンスペっぽく染まり、腎ほど明瞭ではありません。 このような場合にTriton−Xなどの処理で解決することができたりするのでしょうか？その場合トピ主さんのようにブロッキングの際に行うのが一番よいのでしょうか？教えてください。

(無題) 削除/引用 No.45-3 - 2009/02/18 (水) 09:41:15 - のーと 膜タンパク質のトポロジーを見るのであれば、 tritonのありなしだけでなく、trypsin処理により膜タンパク質の分解によってちゃんとシグナルが消えるかどうかを見てみるとよいです。 参考文献 Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n3/abs/nmeth857.html

(無題) 削除/引用 No.45-2 - 2009/02/18 (水) 09:22:17 - ape 免染での界面活性剤はノンスペの原因になる一次抗体の弱い非特異的結合を剥がす役割だと認識しています。ですので界面活性剤無しで良い結果が出ているなら、一次抗体の特異性が高いことを示しているのでは。

免疫染色の界面活性剤 削除/引用 No.45-1 - 2009/02/17 (火) 21:50:48 - RSC いつもお世話になっています。 このたび、ある膜タンパク質を免疫染色(蛍光)で検討することになりました。 サンプルはDRG初代培養系です。 そのタンパクは、N末端が膜外にあり、C末が膜内にあり、今回使用した抗体はC末を認識していると添付文書に記載されています。 ブロッキングバッファーにTriton X-100/PBSにBSAを溶解させたもので行った結果、おおよそ予想通り膜上にあるのが認められました。 その後、実験ディスカッションで界面活性剤を抜いて行ったら、どうなるかやってみようということになりました。 私の認識では、Tritonのような界面活性剤は、ブロッキングの役割と抗体などの膜を透過できるようにする役割でした。 なので、予想では染まらないであろうと思ったのですが、実際に行ったところ、界面活性剤がある場合とさほど変わりませんでした。 ちなみに、一次抗体を抜いたものではバックが高くなるくらいたったので、今回の結果はノンスペのシグナルではない可能性が高いと考えてます。 過去の論文報告で、同じ抗体でDRG組織を界面活性剤を用いずに行いきちんと染まっており、一抹の不安はありました。 これはどのように考えたらよいのでしょうか？？ 色々と議論しましたが、煮詰まってしまいました。 同じようなご経験のある方、ご教授頂けたら助かります。

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