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(無題) 削除/引用 No.462-4 - 2009/05/13 (水) 21:42:10 - シュン 私の場合は、10mM グルタチオン, 50mM Tris-HCl pH9.0で室温5分で溶出して、なるべくビーズが残らないように2度ほど遠心して完全にビーズを取り除いてから2xSDS sample bufferを加えて、熱変性させてからウエスタンをしています。最初の頃, SDS sample bufferで溶出していたら、やたらノンスペにビーズにくっついて、バックグランドが高くて困りましたが、グルタチオンで溶出するようになってからうまく検出できるようになりました。 後は、NP-40は必要ですか？私の場合は、NP-40などの界面活性剤を加えるとノンスペが増えたり、逆に結合が減ったりしてあまり良くありませんでした。 また、DTTなどの還元剤を加えると、非特異的な結合を減らせると思います。 塩濃度もちょっと振ってみると意外と改善出来るかもしれません。 後は、GSH-sepharoseを加えるタイミングですが、私の場合は、GSTとHis-tagを混ぜた物を4度で2時間振った後に、予め同じバッファーで平衡化したGSH sepharoseを加えて、4度で30分振ってから、洗浄していました。 それぞれのタンパクで結合条件が同じではないと思いますので、いろいろとパラメーターを振ってみて、条件検討してみると良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.462-3 - 2009/05/13 (水) 17:33:59 - おお 1はいいのですが、その理由は2というよりは、 1自身がレジンにあふぃニティ-がありレジンが多いほど、 レジンに直接ついた物を除きにくくなっていると考えられませんか? ですから、GST融合タンパクやGSTをの量をふやすとある程度は ノンすべを下げれるかもしれませんが、レジンの量を減らした方が 無難とおもいます(文字化けでレジンの量がわからないですが)。 あとはグルタチオンで溶出するとレジン直接相互作用したHIS融合 たんぱく質の溶出は防げるかもしれません。 洗いの回数は3回で大抵は十分ですがま、ノンスペが出るというので あれば5ー6回位洗っても良いと思います。 一般論としてこの様なタンパクとレジンとの直接的な相互作用を おさえるために、でタージェンとの濃度をあげるとか、塩濃度を 上げる事があります。 たんぱく質量も500ngも必要でしょうか?50ng位でもいいかなとも思えます。 あとはHISをNiレジンでぷるダウンしてGSTか特異的な抗体で 検出というてもあるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.462-2 - 2009/05/13 (水) 17:14:57 - ーー １、結構かどうかはわかりませんが、理論上、あると思います。 確かめるのは簡単なのでご確認をお勧めします。 ブロッキングの効果はわかりません。 予想ですが、BSAが多量に入っている実験系でも起こることなので 効果は望めないのではないでしょうか。 ２、タンパク質の量は関係しないと思います。 私はGSTタンパク質が検出できるくらいの量を入れて実験しておりますが、 その量が多い時少ない時とあまり変化はありません。 おそらく 多くGSTタンパク質を入れたらビーズに非特異でタンパク質がくっつく余地がない というのを想像していらっしゃると思いますが、それは個人的にはあまり正しい想像とは思いません。 ３、タンパク質によっては、あると思います。 すべて、簡単に確かめることが出来ると思います。 使っているタンパク質が全く同じ人で、全く同じ実験をしている人がわかれば 有用な情報も得られるかと思いますが、 タンパク質はそれぞれ性質が異なりすぎますので、あまりここで聞くことは参考にならない気が 私はします。

GST pull-down assay 削除/引用 No.462-1 - 2009/05/13 (水) 16:45:29 - pkmf いつも大変お世話になっております。 表題の件について、教えていただきたいことがございまして トピックを立てさせていただきます。 以下、ちょっと長くなってしまい申し訳ございません。 現在、既知の精製タンパク質２種類（A, Bと名前を付けます）の結合を GST pull-down assayにより確認しております。 AにはGSTタグ、BにはHisタグをつけており、発現・精製後はほぼ単一バンドとなっていることをCBB染色並びにWesternにより確認しております。 このタンパク質を用いてpull-downアッセイを行っているのですが、 検出時（anti-HisのWestern）には、ネガコンとしてGSTを用いたものでも、タンパク質Bが落ちてきてしまいます。 以下にプロトコールの概要を示します。 GST-A 500ng His-B 500ng BSA final 100µg/ml Glutathione Sepharose (50% slurry) 20µl Binding buffer 25mM Tris-Cl, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.1% NP-40 ↓ 1hr at room temp. ↓ c.f.g ↓ wash with Binding buffer x3 ↓ add 2x SDS-PAGE sample buffer ↓ SDS-PAGE/ Western という感じです。 自分が気にしているのは、 　1.　タンパク質Bがセファロースに非特異的にくっついてしまっている？ 　2. それはセファロースあたりに持ち込んでいるGST融合タンパクの量が少ないから？ 3. 反応中にタンパク質Bが不溶化してしまい、そのせいで落ちてきている。 ということです。 １のようなタンパク質はけっこうあるのでしょうか？ あるとしたら、ブロッキングのような作業が出来たらと思うのですが、そのようなことは可能なのでしょうか？ ２については、GST融合タンパクとセファロースをあらかじめ結合させておくことが可能だと思われますが、みなさんはどれくらいのタンパク質をセファロースあたり加えていますでしょうか？ 長文申し訳ありませんが、ご回答いただけたらうれしく思います。 よろしくお願い致します。

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