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「おお」さん説明ありがとうございます 削除/引用 No.478-12 - 2009/05/15 (金) 15:55:37 - み 「おお」さん説明ありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.478-11 - 2009/05/15 (金) 14:49:59 - おお >[Re:10] おおさんは書きました : > >[Re:9] みさんは書きました : > > > > SDS-PAGEでは多量のSDSが分子に付着しているからリン酸化ごときの電荷なんて殆ど影響ないと思っていました。 > > 実際1グラムのたんぱく質に1.4-1.4グラムのSDSということだったと思うので、 1.4-1.4グラム->1.4-1.7グラム

(無題) 削除/引用 No.478-10 - 2009/05/15 (金) 14:46:32 - おお >[Re:9] みさんは書きました : > SDS-PAGEでは多量のSDSが分子に付着しているからリン酸化ごときの電荷なんて殆ど影響ないと思っていました。 実際1グラムのたんぱく質に1.4-1.4グラムのSDSということだったと思うので、計算してけばどれくらいの量か想像できると思いますが、、、やったことはありません。平均アミノ酸分子量110とするとそんなにいっぱいという感じはしないですね、、、 > リン酸化されて分子量が大きくなり移動度が遅くなるのが一般的と思っていましたが、「その学会での指摘」って正しいのですか？ 残念ながら回答は持っていません。 当時(1990年初頭位だったと思います)燐酸かされたたんぱく質 の解析はあまり数がなく電荷を考えると 移動度が遅くなると言う事が理解できなかったのだと思います。 そのタンパクは1個所だけでなく多分10個所ぐらい燐酸か部位をもち 燐酸化の数によって徐々に上にシフトしているようなイメージが ウエスタンでえられます。タウ何かもそうですよね。 燐酸化で分子量が確かに大きくなりますが、molecular biology of the cell(だったとおもう)などの説明だと、SDSの疎水性の部分がペプチドにつき、マイナスの電荷が外に突き出た状態になり、タンパクの表面から突き出ているSDSのマイナスの電荷はお互いに反発するため、マイナス電荷同市の間隔がより広く、間隔に偏りのないペプチドが線状化した状態で落ち着くような説明になってます。 例えばポリペプチドの真ん中へんのセリンとかチロシンが燐酸化しても線状化した長さは変わりありませんし、この線状化した長さでサイズに依存した移動度が決まるとすればどうも燐酸かにより移動度の違いは説明できません。 一つのスペキュレーションとして、燐酸化されたあたりのペプシチドが、燐酸の負電荷のためSDSの結合量が、燐酸かにより負電荷以上ににへり、サイズあたりの負電荷量がへり移動度が遅れるのではないかとか想像できます。 さらに燐酸かした部位のSDSの結合量が少なくなることにより、SDS化された直線状のペプチドが若干まがったりとかで移動度がかわるかもしれませんし、 ということで書けば切りがなく、すべて想像の域をでませんので移動度が早くなった遅くなったというところで行き詰まったと考えるより、実際燐酸かで動いているのか確認するほうがいいと言う事でコメントを書いた次第です。

おおさん可能なら教えて下さい 削除/引用 No.478-9 - 2009/05/15 (金) 13:07:44 - み >[Re:7] おおさんは書きました : > >[Re:6] おおさんは書きました : > > > 学会の発表では燐酸かして負電荷が増えるのに何で移動度が上がるのかとさんざん突っ込まれたようです。 > > 移動度が上がる > > というのはちょっと変な表現ですね。 > > ->移動度が遅くなる > とすればいいかな。訂正いたします。 SDS-PAGEでは多量のSDSが分子に付着しているからリン酸化ごときの電荷なんて殆ど影響ないと思っていました。 リン酸化されて分子量が大きくなり移動度が遅くなるのが一般的と思っていましたが、「その学会での指摘」って正しいのですか？ 混乱しています。

(無題) 削除/引用 No.478-8 - 2009/05/15 (金) 13:04:53 - とも 名無し様、BAP様、おお様 助言ありがとうございます。 リン酸化の実験を今回初めてやったので、言われていることと違った結果がでて、ビックリしました。 やはり本当に脱リン酸が起っているのかを見た方がよさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.478-7 - 2009/05/15 (金) 10:41:04 - おお >[Re:6] おおさんは書きました : > 学会の発表では燐酸かして負電荷が増えるのに何で移動度が上がるのかとさんざん突っ込まれたようです。 移動度が上がる というのはちょっと変な表現ですね。 ->移動度が遅くなる とすればいいかな。訂正いたします。

(無題) 削除/引用 No.478-6 - 2009/05/15 (金) 09:50:47 - おお 一般的に燐酸化で上にシフトすることがおおく、場合によっては 燐酸かでもシフトが見られないというのがマジョリティーだとおもいます。 ただし、燐酸かで下にシフトしてもおかしくないと個人的には 思っています。 1980年後半から1990年ごろある人があるタンパクの燐酸化を見つけました。 その時燐酸かによって上にシフトしたのですが(今日のコンセンサスとなっているように)、学会の発表では燐酸かして負電荷が増えるのに何で移動度が上がるのかとさんざん突っ込まれたようです。 ま、おかしいと思い込まずに、少し突っ込んで燐酸かが外れている ことを念のために確認するといいかと思います。 例えば2Dとか、燐酸かタンパク吸着用カラムへのあふぃにティの 違いとか、マスや燐酸かアミノ酸に対しての 抗体など、選択肢は幾らかあると思います。 名無し様が仰ってますように燐酸かが移動度に影響を与える と考えられるファクターは色々考えられます。考えていろいろ 考察するのはある程度必要ですが、実験としては燐酸かが外れたことが 重要なはずなので、わけて考えるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.478-5 - 2009/05/15 (金) 06:26:06 - BAP バンドが上にシフトした経験はありませんが 以前、同様の実験をBAPを用いて行い、あるリン酸化タンパク質に対する抗体でWBした所、ばっちりBAP由来のバンドを検出してしまいました。 幸い？私の場合、目的タンパク質とBAPの分子量に大きな差がありましたし、BAPのみのコントロールを置いていたため問題にはなりませんでしたが。 質問者様の詳細な実験系がわからないのでなんとも言えませんし、まぁ違うとは思いますが念のために。

(無題) 削除/引用 No.478-4 - 2009/05/14 (木) 21:03:33 - 名無し SDS-PAGEの微妙な移動度変化は蛋白質の性質やSDSのつき具合や荷電状態や構成アミノ酸の組成やそれにリン酸化ありなしがまた絡むなどいろんなファクターの影響受けた総合的な結果だから、こうしたらこうなるハズ、なのに違うみたいに考えはじめると切りないのであまりこだわりすぎない方がいいかもとか思う。とりあえずこの蛋白質ではちょっと予想と違う変わった動きするんだなあ、くらいで先に進めたほうがいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.478-3 - 2009/05/14 (木) 19:45:09 - とも すみません。 間違えました。 上にシフトしました。

http:// 削除/引用 No.478-2 - 2009/05/14 (木) 19:41:20 - TK-1 通常、下にシフトするんじゃないですか。 なぜ、上にシフトすると思うのですか？

リン酸化タンパクのホスファーターゼ処理 削除/引用 No.478-1 - 2009/05/14 (木) 19:31:22 - とも リン酸化タンパク質をホスファターゼ（CIP)で処理したのですが、通常バンドが上にシフトすると思うのですが、下にシフトしました。 こんな現象を見たことある人いますか？

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