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(無題) 削除/引用 No.484-14 - 2009/05/18 (月) 17:11:46 - 小言幸兵衛 「なぜ」というのは曖昧な疑問詞で、どのレベルを問うているかを明確にしないと。 例えば、「・タンパク質発現用の宿主はなぜバクテリオファージλDE3の溶原菌なのか」という質問では、（１）T7ポリメラーゼがλDE3から供給されていることが分かっていないのか、（２）λDE3であってλCE6等を使わない理由を聞いているのか、（３）ゲノムにT7ポリメラーゼを挿入する方法として λファージを使った理由を聞いているのかが定かではありません。「なぜ、λDE3にT7 RNA polymeraseがコードされているのか」、「λDE３以外ではいけなかったのか」という補足があっても、相変わらず（２）と（３）の可能性が残ります。 ２番目の質問はNo.484-3参照。 ３番目、５番目の質問はおおさんがお答えになっています。 ４番目の質問は、いったい何のオペレーターの話でしょうか。T7プロモーターはT7ポリメラーゼの有無で発現が制御されているのに、何のリプレッサーが結合するとお考えなのですか。

(無題) 削除/引用 No.484-12 - 2009/05/18 (月) 07:30:07 - おお >[Re:11] ittoさんは書きました : > > >おおさん > > 質問の仕方が下手で申し訳ございません。 > 「λDE３以外ではいけなかったのか」と質問したかったのです。 いや私の答えは的を得ていなかったことは承知していました。 逆にそれくらいのことしか、文献をさかのぼらないとはっきり 言えないと言うことが分かってもらえるかと思った次第です。 多分λDE３以外でもよかったんだろうなっとおもいます。 当時の、あるいは作った人のチョイスとしてほかに何が あったかということもありますから。 λDE3はT7RNApolymerase発現によく使われているようですし、 λDE3を作ったあたりの論文までさかのぼらないと分からない かもしれません。 ただいえることは、 λDE3を持ってない大腸菌に λDE3を感染 する事でリコンビナントを作る系では、代わりにT7ファージを 感染させると、T7ファージのタンパクもT7RNApolymeraseで 誘導されてしまいますね。 また、このλDE3を感染させる系では、感染効率がよくないといけない ので、ファージを選んでいるようなきがします(たとえば感染の 代わりにプラスミドを使うと、誘導の時感染より非常に効率の悪い プラスミドのトランスフォーメーションになってしまいます)。 そうやってλDE3を感染させて、リコンビナントを作る系があったからλDE3をキャリーする大腸菌が使われるようになったのではと思えます。 F'エピソームに載っけていても多分BL21(λDE３)と同様の系ができてた かもしれません。 λDE3はなぜλphageに載っけたかはλphageはよく調べられていて 使いやすいツールだったとはおもいますが、それ以外に理由が あるかどうかはわかりません。 以上が私の想像です。 リファレンスを探っていけばその想像が最もらしいか どうかある程度察しがつくのではとおもいます。 > > APさんのおっしゃられるようにリファレンスを遡っていくしかなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.484-11 - 2009/05/18 (月) 00:37:00 - itto みなさん、回答してくださりありがとうございます。 >APさん マニュアルは読んで、のっていなかったところを質問させていただいたつもりだったのですが・・・・説明されていたでしょうか？ でしたら申し訳ございません。 もう一度読んでみます。 >おおさん 質問の仕方が下手で申し訳ございません。 「λDE３以外ではいけなかったのか」と質問したかったのです。 APさんのおっしゃられるようにリファレンスを遡っていくしかなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.484-10 - 2009/05/17 (日) 11:55:31 - AP >この辺のことについてすべて理由をつけようとすると歴史的な経緯を >追わないとちょっとすべては説明できないかもしれませんね。 さきほど挙げたNovagenのマニュアルにはreferenceもちゃんとのっていますので、本気で知りたい人は自ら、原著論文(NovyとかStudierとか）や、さらにそのなかで挙げられているreferenceまでさかのぼって勉強したらいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.484-9 - 2009/05/17 (日) 10:38:18 - おお >[Re:6] ittoさんは書きました : > > λＤＥに関しては、なぜ、λＤＥにT7 RNA polymeraseがコードされているのか、ということだったのですが・・・ > T7 RNA polymerase 大腸菌で発現させた時の、T7 プロモーターへの高い特異性と強い活性がこのポリメラーぜが選ばれた理由ではないかと思います。 あと、ファージを感染させてタンパクを合成させる系が昔からあったような 気がします(モレキュラークローニングでも紹介されていたと思ったのですが 今手元にありませんし、あまり現在は使われない方法なのではっきりと覚えてませんが) と言う事から、毎回ファージで感染させるというステップから、大腸菌が すでにT7 RNA polymerase がコードされた遺伝子を持つ株をつくって、 プロトコールを簡略化したような印象があります。 この辺のことについてすべて理由をつけようとすると歴史的な経緯を 追わないとちょっとすべては説明できないかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.484-8 - 2009/05/17 (日) 09:59:12 - AP >はい、読みました。 >manualには簡単な説明のみで、ほとんど説明はございませんでした。 メーカーがユーザー向けに提供する資料以上に詳しい情報はないと思いますけれど。Novagenの提供しているfull manualや他の資料を当たった上でのことですか。たとえば、ここからDLできるfull manualの冒頭のdescriptionやsection VII (とくにchapter C以降）は読んだんでしょうか？ http://www.merckbiosciences.com/html/NVG/pettablemenued.html >λＤＥに関しては、なぜ、λＤＥにT7 RNA polymeraseがコードされているのか、ということだったのですが・・・ なぜって、、、、宿主にlac promoter+T7 RNA polのコンストラクトを持たせる手段として、そういうデザインで人為的に作った結果というのでは答えになりませんか？

(無題) 削除/引用 No.484-6 - 2009/05/16 (土) 23:50:57 - itto お答えいただきありがとうございます。 >小言幸兵衛さん はい、読みました。 manualには簡単な説明のみで、ほとんど説明はございませんでした。 >おおさん なるほど。わかりやすい説明ありがとうございました。 λＤＥに関しては、なぜ、λＤＥにT7 RNA polymeraseがコードされているのか、ということだったのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.484-5 - 2009/05/16 (土) 17:51:11 - おお OmpT http://jb.asm.org/cgi/content/abstract/186/17/5919 Argなどの塩基性アミノ酸が並んだ場所が切れやすいそうです。 あとArgー-Gly/Valなどの間も切れるとされています、 そのほか周りの配列にもプレファレンスがあるようです。 トリプシンよりは切れるところが少ないといえるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.484-4 - 2009/05/16 (土) 16:55:33 - おお >[Re:1] ittoさんは書きました : > ・タンパク質発現用の宿主はなぜバクテリオファージλDE３の溶原菌なのか λDE３にT7 RNA polymerase がコードされています。 ただし、タンパク発現がすべてλDE3を含む系である必要はありません。 T7 RNA polymeraseが必要ないシステムもあります(pETシリーズではありませんが)。 > ・T7promoterは他のバクテリオファージのプロモーターではいけなかった 例えばT3 や SP6の RNA polymeraseはT7と違ったDNA配列を認識します。現状使えるツールとしては違うものではうまく機能しないのではとおもえますが、、、 > > ・ｆ１oriの用い方はどのようなものか http://www.promega.com/enotes/faqspeak/0006/fq0024.htm 昔はDNA配列を読むためにssDNAを作っていましたので、この様なori を含むプラスミドは結構多いと思います。M13 oriもそういう目的で つかえます。 > > ・lacオペロンではpromoterとoperatorが重なっているはずですが、pETの配列を見てみるとそうでないようなのはなぜか 重なっているでしょうか? operator が転写開始位置の若干下流にある絵を見ています。 プロモーターは転写開始位置の上流にあります。 これはpETのシステムもプロモーターの下流にlacIの結合配列を挿入している ので同じように見えます(配列では見たことがありませんが)。 > > ・ompT・lonプロテアーゼの切断タンパク質の配列はどのようか > これは意識したことがなかったですね。 文献やプロテアーゼのデーターベースなどで分かると思えますが、、、

(無題) 削除/引用 No.484-3 - 2009/05/16 (土) 16:39:58 - 小言幸兵衛 本当にmanualをお読みになりましたか？ ２番目のご質問については、他のものでも良かった可能性はあるけれど、T7の研究者が早くにこのシステムを確立してしまったということだと思います。特許の問題もあったかもしれません。 最後のご質問については、配列特異性は高くないと思います。 それ以外のご質問については、manualに説明があるはずです。

補足 削除/引用 No.484-2 - 2009/05/16 (土) 16:33:27 - itto T7以外というのは、T3やSP６なども遺伝子工学的によく利用されていると思うのですが、なぜｐETではそれらではなくT7なのかということです。 ご存知の方いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。

pET systemについて 削除/引用 No.484-1 - 2009/05/16 (土) 14:52:40 - itto pET systemについてなのですが、manualからではわからないことが多々ありましたので、どなたか教えてくださったらと思いトピックを作らせていただきました。 ・タンパク質発現用の宿主はなぜバクテリオファージλDE３の溶原菌なのか ・T7promoterは他のバクテリオファージのプロモーターではいけなかったの ・ｆ１oriの用い方はどのようなものか ・lacオペロンではpromoterとoperatorが重なっているはずですが、pETの配列を見てみるとそうでないようなのはなぜか ・ompT・lonプロテアーゼの切断タンパク質の配列はどのようか もし一つでも分かる方いらっしゃいましたら、説明の程よろしくお願いいたします。

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