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Dynabeads 削除/引用 No.492-7 - 2009/05/20 (水) 03:59:00 - Tb Protein Gビーズではありませんが、tosylated Dynabeadsに表面分子に対する抗体をつけたことがあります。目的はタンパク取りだったのですが、ビーズコートの確認と遊びこごろでその分子をFACSでみてやや弱めの強度で発現する細胞に対し分けられるか使ってみました。予想に反し、まったく分けられませんでした。（ちなみに、その分子のi.p.には問題なくワークしてくれましたのでカップリングには問題ないはずです。）DynabeadsはMACSなどと比較して弱い発現の細胞には向かないというのが印象です。Dynabeadsは細胞に近い大きさですから、くっついあとピペッティングやボルテックスなどのシェアストレスとかに耐えうるには、かなりの抗体−分子の結合数が必要なのでしょう。トピ主さんの場合も発現強度が弱いと思いますので、Dynabeadsは向いてないように思います。plateへのpanningも強いとは思えませんので、FACSソーターを一番として、次点としてMACSをおすすめします。anti-FITC (あるいはanti-PEなど) MACS beadsを使ってみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.492-6 - 2009/05/19 (火) 18:59:46 - ~ これは何か既知の細胞膜上のタンパク質を発現するベクターを入れて操作すればうまくいく方法なのでしょうか？ 貴方の操作に膜状タンパク質で細胞を釣ってこれるというポジコンがないので、この方法を多少改良するだけで回収できるのか、他に力をかけるべきなのかが分かりません。 このような実験であれば、ポジコンはおくべきではないでしょうか。 200個に1個が陽性であれば、 96ウェルプレート5枚位に撒いてレプリカを作った上で、分子A融合タンパク質で検出すれば取れますよね。 このくらいの数であれば、プールを作るよりも、シングルで取った方が早いと思います。 FACSということはソーターがあるのですか？ ポジティブクローンをソートすれば、ビーズ無しに濃縮できるでしょう。 FACSで擬陽性ではないと考えられる陽性細胞が見えるのでしたら、 近所の大学にFACSを借りに行くのも含めて、FACSでの回収を考えるのが早いと思います。

(無題) 削除/引用 No.492-5 - 2009/05/19 (火) 17:45:46 - 中年 No.492-2のコメントにある「10クローンずつ」は、「100-1,000クローンずつ」に訂正させてください。

(無題) 削除/引用 No.492-4 - 2009/05/19 (火) 11:47:05 - DNAI 一過性発現細胞株（COS）によるFACSにおいて0.5％の陽性とありますが、 この時のネガコン（non transfected COS）では全く陽性を示しませんか？ 0.5％というのは非特異シグナル（結合）の可能性もあるのかなと。 特異的なシグナルならば、ビーズではなくsortingという手もありますね。

(無題) 削除/引用 No.492-3 - 2009/05/19 (火) 11:10:16 - ？ > FACSの解析から0.5%陽性がいたので、計算上は2.5×10^5個は取れる この計算がよく分かりません。0.5% は細胞の数であって、総蛋白の 0.5% が目的の蛋白というわけではないですよね。ましてや全 mRNA の 0.5% が目的のものとは言えないでしょう。 単純に ・元々の mRNA 発現量が低い ・cDNA 合成で CDS 全長を含む物が少ない（3' non-coding が長いなど） ・ライブラリ作成時に短いインサートが優先的に組み込まれてしまっている といった点がまず疑われます。合成した cDNA をサイズ分画して、それぞれからライブラリを合成すれば、目的の cDNA が濃縮できるかもしれません。 中年さんが書かれてるように、cDNA を小さなプールに分ければ感度が上がる場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.492-2 - 2009/05/19 (火) 10:17:49 - 中年 お尋ねの点に対する直接の回答でなくてすみません。 0.5%も陽性細胞がいるほど高発現のリガンドなら、そのcDNAライブラリーをランダムに10クローンずつプールしてトランスフェクションし、陽性の出るプールをクローンに分けた方が早くはないですか？

リガンド探索について 削除/引用 No.492-1 - 2009/05/18 (月) 22:39:10 - 0120333906 お世話になっています。 ヒト神経細胞表面に出ている分子Aに対するリガンドを探索していますが、最初からつまずいてしまい、皆様のご指摘をいただければと思い投稿します。 分子Aのリガンドが対象細胞に発現していることは、分子AとヒトIgG1の融合タンパクを用いたFACSで確認しました。 （１）対象細胞からmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製。 （２）COS７細胞へ一過性にトランスフェクション （３）２日後にCOS７を回収し、分子A融合タンパクと反応させる（４度、1時間） （４）洗浄後、dynalプロテインGビーズを添加（４度、１時間） （５）ビーズに付着したCOS7を磁場を用いて回収 （６）プラスミドを回収 （７）再びCOS7へトランスフェクション これを繰り返す予定だったのですが、（５）の細胞の回収のところでつまずいています。細胞の回収にはプレートを用いてパニング法が良いかとも思ったのですが、dynalのビーズがラボに沢山あったため、それを使用しています。極端に言うと細胞が1つも回収できていないというのが現状です。トランスフェクションしたCOS7細胞が5×10^7個で、FACSの解析から0.5%陽性がいたので、計算上は2.5×10^5個は取れると思うのですが、全く回収できません。 パニングのほうが検出感度が高いのでしょうか。経験がないためわかりません。 宜しくお願いします。

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